प्रोटीन फोल्डिंग
प्रोटीन फोल्डिंग (Protein folding) वह भौतिक प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक प्रोटीन, राइबोसोम द्वारा अमीनो अम्ल की एक रैखिक श्रृंखला के रूप में संश्लेषण के बाद, एक अस्थिर रैंडम कॉइल से एक अधिक व्यवस्थित त्रि-आयामी संरचना में बदल जाता है। यह संरचना प्रोटीन को जैविक रूप से कार्यात्मक या सक्रिय बनने की अनुमति देती है।[1]
कई प्रोटीनों की फोल्डिंग पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अनुवाद (translation) के दौरान ही शुरू हो जाती है। अमीनो अम्ल एक-दूसरे के साथ परस्पर क्रिया करके एक सुव्यवस्थित त्रि-आयामी संरचना का निर्माण करते हैं, जिसे प्रोटीन की नेटिव स्टेट (native state) कहा जाता है। यह संरचना अमीनो-अम्ल अनुक्रम या प्राथमिक संरचना द्वारा निर्धारित होती है।[2]
सही त्रि-आयामी संरचना कार्य के लिए आवश्यक है, हालांकि कार्यात्मक प्रोटीन के कुछ हिस्से अनफोल्डेड (बिना मुड़े) रह सकते हैं,[3] जो यह दर्शाता है कि प्रोटीन गतिकी (protein dynamics) महत्वपूर्ण है। नेटिव संरचना में फोल्ड होने में विफलता आमतौर पर निष्क्रिय प्रोटीन उत्पन्न करती है, लेकिन कुछ मामलों में, गलत तरीके से मुड़े हुए (misfolded) प्रोटीन में संशोधित या विषाक्त कार्यक्षमता होती है। माना जाता है कि कई न्यूरोडीजेनेरेटिव और अन्य रोग गलत तरीके से मुड़े हुए प्रोटीनों द्वारा निर्मित अमाइलॉइड फाइब्रिल्स के संचय के परिणामस्वरूप होते हैं, जिनकी संक्रामक किस्मों को प्रायन (prions) के रूप में जाना जाता है। कई एलर्जी कुछ प्रोटीनों के गलत फोल्डिंग के कारण होती हैं क्योंकि प्रतिरक्षा प्रणाली कुछ प्रोटीन संरचनाओं के लिए एंटीबॉडी का उत्पादन नहीं करती है।
प्रोटीन का विकृतीकरण (Denaturation) फोल्डेड अवस्था से अनफोल्डेड अवस्था में संक्रमण की एक प्रक्रिया है। यह खाना पकाने, जलन, प्रोटीनपैथी और अन्य संदर्भों में होता है। कथित तौर पर अनफोल्डेड अवस्था में मौजूद अवशिष्ट संरचना (यदि कोई हो) एक फोल्डिंग दीक्षा स्थल बना सकती है और बाद की फोल्डिंग प्रतिक्रियाओं का मार्गदर्शन कर सकती है।[4]
फोल्डिंग प्रक्रिया की अवधि संबंधित प्रोटीन के आधार पर नाटकीय रूप से भिन्न होती है। जब कोशिका के बाहर अध्ययन किया जाता है, तो सबसे धीमी गति से फोल्ड होने वाले प्रोटीनों को फोल्ड होने में कई मिनट या घंटे लगते हैं, मुख्य रूप से प्रोलाइन आइसोमेराइजेशन के कारण, और प्रक्रिया पूरी होने से पहले उन्हें चेकपॉइंट्स की तरह कई मध्यवर्ती अवस्थाओं से गुजरना पड़ता है।[5] दूसरी ओर, सौ अमीनो एसिड तक की लंबाई वाले बहुत छोटे एकल-प्रोटीन डोमेन प्रोटीन आमतौर पर एक ही चरण में फोल्ड हो जाते हैं। मिलीसेकंड का समय पैमाना सामान्य है, और सबसे तेज़ ज्ञात प्रोटीन फोल्डिंग प्रतिक्रियाएं कुछ माइक्रोसेकंड के भीतर पूरी हो जाती हैं। प्रोटीन का फोल्डिंग समय पैमाना उसके आकार, संपर्क क्रम (contact order) और सर्किट टोपोलॉजी पर निर्भर करता है।
प्रोटीन फोल्डिंग प्रक्रिया को समझना और उसका अनुकरण करना 1960 के दशक के अंत से कम्प्यूटेशनल जीव विज्ञान के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती रही है।
प्रोटीन फोल्डिंग की प्रक्रिया
प्राथमिक संरचना
মূল নিবন্ধ: प्रोटीन प्राथमिक संरचना
प्रोटीन की प्राथमिक संरचना, उसका रैखिक अमीनो-अम्ल अनुक्रम, उसके नेटिव विन्यास (conformation) को निर्धारित करता है।[6] पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में विशिष्ट अमीनो एसिड अवशेष और उनकी स्थिति यह निर्धारित करने वाले कारक हैं कि प्रोटीन के कौन से हिस्से एक साथ मजबूती से फोल्ड होते हैं और इसकी त्रि-आयामी संरचना बनाते हैं। अमीनो एसिड संरचना अनुक्रम जितनी महत्वपूर्ण नहीं है। हालाँकि, फोल्डिंग का आवश्यक तथ्य यह है कि प्रत्येक प्रोटीन का अमीनो एसिड अनुक्रम उस जानकारी को समाहित करता है जो नेटिव संरचना और उस अवस्था को प्राप्त करने के मार्ग दोनों को निर्दिष्ट करती है। इसका मतलब यह नहीं है कि लगभग समान अमीनो एसिड अनुक्रम हमेशा समान रूप से फोल्ड होते हैं। विन्यास पर्यावरणीय कारकों के आधार पर भिन्न होते हैं; समान प्रोटीन इस आधार पर अलग तरह से फोल्ड होते हैं कि वे कहाँ पाए जाते हैं।
द्वितीयक संरचना
মূল নিবন্ধ: प्रोटीन द्वितीयक संरचना
द्वितीयक संरचना का निर्माण फोल्डिंग प्रक्रिया का पहला चरण है जिसे एक प्रोटीन अपनी नेटिव संरचना को ग्रहण करने के लिए अपनाता है। द्वितीयक संरचना की विशेषता वे संरचनाएं हैं जिन्हें अल्फा हेलिक्स और बीटा शीट के रूप में जाना जाता है, जो तेजी से फोल्ड होती हैं क्योंकि वे इंट्रामोल्युलर हाइड्रोजन बॉन्ड द्वारा स्थिर होती हैं, जैसा कि पहली बार लिनस पॉलिंग द्वारा वर्णित किया गया था। इंट्रामोल्युलर हाइड्रोजन बॉन्ड का निर्माण प्रोटीन स्थिरता में एक और महत्वपूर्ण योगदान प्रदान करता है।[7] α-हेलिक्स सर्पिल आकार बनाने के लिए बैकबोन की हाइड्रोजन बॉन्डिंग द्वारा बनते हैं (दाईं ओर का चित्र देखें)। β प्लीटेड शीट एक ऐसी संरचना है जो हाइड्रोजन बॉन्ड बनाने के लिए बैकबोन के स्वयं के ऊपर मुड़ने से बनती है (जैसा कि बाईं ओर के चित्र में दिखाया गया है)। हाइड्रोजन बॉन्ड पेप्टाइड बॉन्ड के एमाइड हाइड्रोजन और कार्बोनिल ऑक्सीजन के बीच होते हैं। एंटी-पैरेलल β प्लीटेड शीट और पैरेलल β प्लीटेड शीट मौजूद होती हैं, जहाँ एंटी-पैरेलल β शीट में हाइड्रोजन बॉन्ड की स्थिरता अधिक मजबूत होती है क्योंकि यह समानांतर शीट द्वारा गठित तिरछे हाइड्रोजन बॉन्ड की तुलना में आदर्श 180 डिग्री कोण के साथ हाइड्रोजन बॉन्ड बनाती है।
तृतीयक संरचना
মূল নিবন্ধ: प्रोटीन तृतीयक संरचना
α-हेलिक्स और β-शीट आमतौर पर एम्फीपैथिक (amphipathic) होते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके पास एक हाइड्रोफिलिक (जल-स्नेही) और एक हाइड्रोफोबिक (जल-विरोधी) हिस्सा होता है। यह क्षमता प्रोटीन की तृतीयक संरचना बनाने में मदद करती है जिसमें फोल्डिंग इस तरह होती है कि हाइड्रोफिलिक पक्ष प्रोटीन के आसपास के जलीय वातावरण का सामना करते हैं और हाइड्रोफोबिक पक्ष प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक कोर का सामना करते हैं।[8] द्वितीयक संरचना पदानुक्रमित रूप से तृतीयक संरचना निर्माण का मार्ग प्रशस्त करती है। एक बार जब प्रोटीन की तृतीयक संरचना बन जाती है और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर हो जाती है, तो दो सिस्टीन अवशेषों के बीच डाइसल्फाइड ब्रिज के रूप में सहसंयोजक बंधन भी हो सकते हैं। ये गैर-सहसंयोजक और सहसंयोजक संपर्क प्रोटीन की नेटिव संरचना में एक विशिष्ट टोपोलॉजिकल व्यवस्था लेते हैं। प्रोटीन की तृतीयक संरचना में एक एकल पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला शामिल होती है; हालाँकि, फोल्डेड पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं की अतिरिक्त परस्पर क्रियाएं चतुर्धातुक संरचना (quaternary structure) के निर्माण को जन्म देती हैं।
चतुर्धातुक संरचना
মূল নিবন্ধ: प्रोटीन चतुर्धातुक संरचना
तृतीयक संरचना कुछ प्रोटीनों में चतुर्धातुक संरचना के निर्माण का मार्ग प्रशस्त कर सकती है, जिसमें आमतौर पर उन सबयूनिट्स का "संयोजन" या "सह-संयोजन" शामिल होता है जो पहले ही फोल्ड हो चुके हैं; दूसरे शब्दों में, कई पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं पूरी तरह से कार्यात्मक चतुर्धातुक प्रोटीन बनाने के लिए परस्पर क्रिया कर सकती हैं।[9]
प्रोटीन फोल्डिंग के प्रेरक बल
फोल्डिंग एक स्वतःस्फूर्त प्रक्रिया है जो मुख्य रूप से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन, इंट्रा-मॉलिक्यूलर हाइड्रोजन बॉन्ड के निर्माण, और वैन डेर वाल्स बलों द्वारा निर्देशित होती है, और यह कन्फर्मेशनल एंट्रॉपी द्वारा बाधित होती है।[10] एक पृथक प्रोटीन का फोल्डिंग समय पैमाना उसके आकार, संपर्क क्रम, और सर्किट टोपोलॉजी पर निर्भर करता है। कोशिकाओं के भीतर, फोल्डिंग की प्रक्रिया अक्सर को-ट्रांसलेशनल रूप से शुरू होती है, ताकि प्रोटीन का N-टर्मिनस फोल्ड होना शुरू हो जाए जबकि प्रोटीन का C-टर्मिनल हिस्सा अभी भी राइबोसोम द्वारा संश्लेषित हो रहा हो; हालाँकि, एक प्रोटीन अणु बायोसिंथेसिस के दौरान या बाद में स्वतःस्फूर्त रूप से फोल्ड हो सकता है। जबकि इन मैक्रोमोलेक्यूल्स को "स्वयं फोल्ड होने वाला" माना जा सकता है, यह प्रक्रिया विलायक (जल या लिपिड बाइलेयर), लवणों की सांद्रता, pH, तापमान, और को-फैक्टर्स तथा आणविक शैपेरोन की संभावित उपस्थिति पर भी निर्भर करती है।
प्रोटीन की फोल्डिंग क्षमताओं पर सीमित झुकने वाले कोणों या संभव कन्फर्मेशन द्वारा सीमाएं होती हैं। प्रोटीन फोल्डिंग के इन अनुमेय कोणों का वर्णन एक द्वि-आयामी प्लॉट के साथ किया जाता है जिसे रामचंद्रन प्लॉट के रूप में जाना जाता है, जिसे अनुमेय रोटेशन के साई (psi) और फाई (phi) कोणों के साथ दर्शाया गया है।[11]
हाइड्रोफोबिक प्रभाव
प्रोटीन फोल्डिंग को कोशिका के भीतर थर्मोडायनामिक रूप से अनुकूल होना चाहिए ताकि यह एक स्वतःस्फूर्त प्रतिक्रिया हो सके। चूंकि यह ज्ञात है कि प्रोटीन फोल्डिंग एक स्वतःस्फूर्त प्रतिक्रिया है, इसलिए इसे नकारात्मक गिब्स मुक्त ऊर्जा मान ग्रहण करना चाहिए। प्रोटीन फोल्डिंग में गिब्स मुक्त ऊर्जा सीधे एन्थैल्पी और एंट्रॉपी से संबंधित है।[9] नकारात्मक डेल्टा G उत्पन्न होने और प्रोटीन फोल्डिंग के थर्मोडायनामिक रूप से अनुकूल होने के लिए, एन्थैल्पी, एंट्रॉपी, या दोनों शर्तों का अनुकूल होना आवश्यक है।
File:Molecular Dynamics Simulation of the Hydrophobic Solvation of Argon.webm
पानी के संपर्क में आने वाले हाइड्रोफोबिक साइड-चेन की संख्या को कम करना फोल्डिंग प्रक्रिया के पीछे एक महत्वपूर्ण प्रेरक शक्ति है।[12] हाइड्रोफोबिक प्रभाव वह घटना है जिसमें प्रोटीन की हाइड्रोफोबिक चेन प्रोटीन के कोर (हाइड्रोफिलिक वातावरण से दूर) में सिमट जाती हैं। जलीय वातावरण में, पानी के अणु प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों या साइड चेन के चारों ओर एकत्रित होने की प्रवृत्ति रखते हैं, जिससे व्यवस्थित पानी के अणुओं के जल-कवच (water shells) बन जाते हैं। हाइड्रोफोबिक क्षेत्र के चारों ओर पानी के अणुओं का व्यवस्थित होना एक प्रणाली में व्यवस्था को बढ़ाता है और इसलिए एंट्रॉपी में नकारात्मक परिवर्तन (प्रणाली में कम एंट्रॉपी) में योगदान देता है। पानी के अणु इन जल-पिंजरों में स्थिर हो जाते हैं जो हाइड्रोफोबिक कोलैप्स, या हाइड्रोफोबिक समूहों के अंदर की ओर फोल्डिंग को प्रेरित करते हैं। हाइड्रोफोबिक कोलैप्स जल-पिंजरों को तोड़कर प्रणाली में एंट्रॉपी को वापस लाता है, जो व्यवस्थित पानी के अणुओं को मुक्त करता है। ग्लोबुलर फोल्ड प्रोटीन के कोर के भीतर परस्पर क्रिया करने वाले हाइड्रोफोबिक समूहों की बहुलता फोल्डिंग के बाद प्रोटीन स्थिरता में महत्वपूर्ण योगदान देती है, क्योंकि वैन डेर वाल्स बलों (विशेष रूप से लंदन डिस्पर्शन बल) का व्यापक संचय होता है। हाइड्रोफोबिक प्रभाव थर्मोडायनामिक्स में एक प्रेरक शक्ति के रूप में केवल तभी मौजूद होता है जब एक बड़े हाइड्रोफोबिक क्षेत्र वाले एम्फीफिलिक अणु के साथ जलीय माध्यम मौजूद हो। हाइड्रोजन बॉन्ड की मजबूती उनके वातावरण पर निर्भर करती है; इस प्रकार, हाइड्रोफोबिक कोर में समाहित H-बॉन्ड, जलीय वातावरण के संपर्क में आने वाले H-बॉन्ड की तुलना में नेटिव अवस्था की स्थिरता में अधिक योगदान देते हैं।
ग्लोबुलर फोल्ड वाले प्रोटीन में, हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड प्राथमिक अनुक्रम के साथ बिखरे होते हैं, न कि बेतरतीब ढंग से वितरित या एक साथ क्लस्टर होते हैं।[13] हालाँकि, जो प्रोटीन हाल ही में डी नोवो उत्पन्न हुए हैं, जो आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन होने की प्रवृत्ति रखते हैं, वे प्राथमिक अनुक्रम के साथ हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड क्लस्टरिंग का विपरीत पैटर्न दिखाते हैं।
शैपेरोन
आणविक शैपेरोन प्रोटीन का एक वर्ग है जो इन विवो अन्य प्रोटीनों की सही फोल्डिंग में सहायता करता है। शैपेरोन सभी कोशिकीय डिब्बों में मौजूद होते हैं और पॉलीपेप्टाइड चेन के साथ इंटरैक्ट करते हैं ताकि प्रोटीन का नेटिव त्रि-आयामी कन्फर्मेशन बन सके; हालाँकि, शैपेरोन स्वयं उस प्रोटीन की अंतिम संरचना में शामिल नहीं होते हैं जिसकी वे सहायता कर रहे होते हैं।[14] शैपेरोन फोल्डिंग में तब भी सहायता कर सकते हैं जब राइबोसोम द्वारा नवजात पॉलीपेप्टाइड का संश्लेषण किया जा रहा हो। आणविक शैपेरोन अपनी फोल्डिंग प्रक्रिया में प्रोटीन की अन्यथा अस्थिर संरचना को स्थिर करने के लिए बाइंडिंग द्वारा कार्य करते हैं, लेकिन शैपेरोन में उस प्रोटीन की सही नेटिव संरचना को जानने के लिए आवश्यक जानकारी नहीं होती है जिसकी वे सहायता कर रहे हैं; बल्कि, शैपेरोन गलत फोल्डिंग कन्फर्मेशन को रोककर काम करते हैं। इस तरह, शैपेरोन वास्तव में नेटिव संरचना की ओर फोल्डिंग प्रक्रिया में शामिल व्यक्तिगत चरणों की दर को नहीं बढ़ाते हैं; इसके बजाय, वे पॉलीपेप्टाइड चेन के संभावित अवांछित एकत्रीकरण को कम करके काम करते हैं जो अन्यथा उचित मध्यवर्ती की खोज को धीमा कर सकते हैं और वे पॉलीपेप्टाइड चेन के लिए सही कन्फर्मेशन ग्रहण करने हेतु एक अधिक कुशल मार्ग प्रदान करते हैं। शैपेरोन को फोल्डिंग उत्प्रेरक प्रोटीन के साथ भ्रमित नहीं किया जाना चाहिए, जो फोल्डिंग प्रक्रियाओं में धीमी गति के लिए जिम्मेदार रासायनिक प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं। फोल्डिंग उत्प्रेरकों के उदाहरण प्रोटीन डाइसल्फाइड आइसोमेरेज़ और पेप्टिडिल-प्रोलिल आइसोमेरेज़ हैं जो डाइसल्फाइड बॉन्ड के निर्माण या पेप्टाइड समूह के सिस और ट्रांस स्टीरियोआइसोमर्स के बीच इंटरकन्वर्जन में शामिल हो सकते हैं। शैपेरोन को इन विवो प्रोटीन फोल्डिंग की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण दिखाया गया है क्योंकि वे प्रोटीन को "जैविक रूप से प्रासंगिक" बनने के लिए कुशलतापूर्वक अपने उचित संरेखण और कन्फर्मेशन को ग्रहण करने के लिए आवश्यक सहायता प्रदान करते हैं। इसका मतलब यह है कि पॉलीपेप्टाइड चेन सैद्धांतिक रूप से शैपेरोन की सहायता के बिना अपनी नेटिव संरचना में फोल्ड हो सकती है, जैसा कि इन विट्रो किए गए प्रोटीन फोल्डिंग प्रयोगों द्वारा प्रदर्शित किया गया है; हालाँकि, यह प्रक्रिया जैविक प्रणालियों में मौजूद होने के लिए बहुत अक्षम या बहुत धीमी साबित होती है; इसलिए, इन विवो प्रोटीन फोल्डिंग के लिए शैपेरोन आवश्यक हैं। नेटिव संरचना निर्माण में सहायता करने की अपनी भूमिका के साथ, शैपेरोन को प्रोटीन परिवहन, गिरावट जैसी विभिन्न भूमिकाओं में शामिल दिखाया गया है, और वे कुछ बाहरी डिनेचुरेंट कारकों के संपर्क में आने वाले डिनेचर्ड प्रोटीनों को उनकी सही नेटिव संरचनाओं में फिर से फोल्ड होने का अवसर भी देते हैं।
पूर्णतः विकृत (denatured) प्रोटीन में तृतीयक (tertiary) और द्वितीयक (secondary) दोनों संरचनाओं का अभाव होता है, और यह तथाकथित रैंडम कॉइल के रूप में मौजूद होता है। कुछ स्थितियों में कुछ प्रोटीन पुनः वलित (refold) हो सकते हैं; हालाँकि, कई मामलों में, विकृतीकरण अपरिवर्तनीय होता है।[15] कोशिकाएं कभी-कभी अपने प्रोटीन को गर्मी के विकृतकारी प्रभाव से बचाने के लिए एंजाइमों का उपयोग करती हैं जिन्हें हीट शॉक प्रोटीन (चैपेरोन का एक प्रकार) के रूप में जाना जाता है, जो अन्य प्रोटीनों को वलन (folding) और वलित रहने में सहायता करते हैं। हीट शॉक प्रोटीन बैक्टीरिया से लेकर मनुष्यों तक, सभी जांची गई प्रजातियों में पाए गए हैं, जो यह संकेत देते हैं कि वे बहुत पहले विकसित हुए थे और उनका एक महत्वपूर्ण कार्य है। कुछ प्रोटीन कोशिकाओं में चैपेरोन की सहायता के बिना बिल्कुल भी वलित नहीं होते हैं, जो या तो व्यक्तिगत प्रोटीनों को अलग करते हैं ताकि उनका वलन अन्य प्रोटीनों के साथ अंतःक्रियाओं से बाधित न हो, या गलत तरीके से वलित (misfolded) प्रोटीनों को खोलने में मदद करते हैं, जिससे वे सही मूल संरचना में पुनः वलित हो सकें। यह कार्य अवक्षेपण के माध्यम से अघुलनशील अनाकार (amorphous) समुच्चय (aggregates) बनने के जोखिम को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन विकृतीकरण या मूल अवस्था के विघटन में शामिल बाहरी कारकों में तापमान, बाहरी क्षेत्र (विद्युत, चुंबकीय), आणविक भीड़ (molecular crowding), और यहाँ तक कि स्थान की सीमा (अर्थात परिसीमन) शामिल हैं, जिनका प्रोटीन के वलन पर बड़ा प्रभाव पड़ सकता है। विलेय की उच्च सांद्रता, pH की चरम सीमा, यांत्रिक बल और रासायनिक विकृतिकारकों की उपस्थिति भी प्रोटीन विकृतीकरण में योगदान कर सकती है। इन व्यक्तिगत कारकों को सामूहिक रूप से तनाव (stresses) के रूप में वर्गीकृत किया गया है। चैपेरोन कोशिकीय तनाव के समय बढ़ती सांद्रता में मौजूद होते हैं और उभरते हुए प्रोटीनों के साथ-साथ विकृत या गलत तरीके से वलित प्रोटीनों के उचित वलन में मदद करते हैं।
कुछ स्थितियों में प्रोटीन अपने जैव रासायनिक रूप से कार्यात्मक रूपों में वलित नहीं होते हैं। उन तापमानों से ऊपर या नीचे जो कोशिकाओं के रहने के लिए अनुकूल होते हैं, तापीय रूप से अस्थिर प्रोटीन खुल या विकृत हो सकते हैं (यही कारण है कि उबालने पर अंडे की सफेदी अपारदर्शी हो जाती है)। हालाँकि, प्रोटीन की तापीय स्थिरता स्थिर नहीं होती है; उदाहरण के लिए, हाइपरथर्मोफिलिक आर्किया पाए गए हैं जो 122 °C तक के तापमान पर विकसित होते हैं,[16] जिसके लिए निश्चित रूप से यह आवश्यक है कि उनके महत्वपूर्ण प्रोटीनों और प्रोटीन असेंबलियों का पूरा पूरक उस तापमान या उससे ऊपर स्थिर रहे।
बैक्टीरियम E. coli बैक्टीरियोफेज T4 का मेजबान है, और फेज द्वारा एन्कोड किया गया gp31 प्रोटीन (P17313) संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से E. coli चैपेरोन प्रोटीन GroES के समरूप प्रतीत होता है और संक्रमण के दौरान बैक्टीरियोफेज T4 वायरस कणों के संयोजन में इसे प्रतिस्थापित करने में सक्षम है।[17] GroES की तरह, gp31 GroEL चैपेरोनिन के साथ एक स्थिर कॉम्प्लेक्स बनाता है जो बैक्टीरियोफेज T4 के प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन gp23 के इन विवो (in vivo) वलन और संयोजन के लिए बिल्कुल आवश्यक है।
फोल्ड स्विचिंग
कुछ प्रोटीनों की कई मूल संरचनाएं होती हैं, और वे कुछ बाहरी कारकों के आधार पर अपना फोल्ड (वलन) बदल लेते हैं। उदाहरण के लिए, KaiB प्रोटीन दिन भर अपना फोल्ड बदलता रहता है, जो साइनोबैक्टीरिया के लिए एक घड़ी के रूप में कार्य करता है। यह अनुमान लगाया गया है कि PDB (Protein Data Bank) के लगभग 0.5–4% प्रोटीन फोल्ड स्विच करते हैं।[18]
गलत तरीके से वलित प्रोटीन (Misfolded proteins)
মূল নিবন্ধ: Proteinopathy एक प्रोटीन को गलत तरीके से वलित (misfolded) माना जाता है यदि वह अपनी सामान्य मूल अवस्था प्राप्त नहीं कर सकता है। यह अमीनो एसिड अनुक्रम में उत्परिवर्तन (mutations) के कारण या बाहरी कारकों द्वारा सामान्य वलन प्रक्रिया के विघटन के कारण हो सकता है।[19] गलत तरीके से वलित प्रोटीन में आमतौर पर बीटा शीट (β-sheets) होते हैं जो एक सुपरमॉलिक्यूलर व्यवस्था में व्यवस्थित होते हैं जिसे क्रॉस-β संरचना के रूप में जाना जाता है। ये β-शीट-समृद्ध असेंबलियां बहुत स्थिर, बहुत अघुलनशील और आमतौर पर प्रोटीयोलिसिस के प्रति प्रतिरोधी होती हैं। इन फाइब्रिलर असेंबलियों की संरचनात्मक स्थिरता प्रोटीन मोनोमर्स के बीच व्यापक अंतःक्रियाओं के कारण होती है, जो उनके β-स्ट्रैंड्स के बीच बैकबोन हाइड्रोजन बॉन्ड द्वारा बनती हैं। प्रोटीनों का गलत वलन अन्य प्रोटीनों के आगे गलत वलन और समुच्चय या ओलिगोमर्स में संचय को ट्रिगर कर सकता है। कोशिका में एकत्रित प्रोटीनों के बढ़े हुए स्तर अमाइलॉइड-जैसी संरचनाओं के निर्माण की ओर ले जाते हैं जो न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और कोशिका मृत्यु का कारण बन सकते हैं। अमाइलॉइड फाइब्रिलरी संरचनाएं हैं जिनमें अंतर-आणविक हाइड्रोजन बॉन्ड होते हैं जो अत्यधिक अघुलनशील होते हैं और परिवर्तित प्रोटीन समुच्चय से बने होते हैं। इसलिए, प्रोटीसोम मार्ग समुच्चय से पहले गलत तरीके से वलित प्रोटीनों को नीचा दिखाने (degrade) के लिए पर्याप्त कुशल नहीं हो सकता है। गलत तरीके से वलित प्रोटीन एक-दूसरे के साथ अंतःक्रिया कर सकते हैं और संरचित समुच्चय बना सकते हैं और अंतर-आणविक अंतःक्रियाओं के माध्यम से विषाक्तता प्राप्त कर सकते हैं।
एकत्रित प्रोटीन प्रियन-संबंधित बीमारियों जैसे क्रूट्सफेल्ड-जैकोब रोग, बोवाइन स्पॉन्जिफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (मैड काउ डिजीज), अमाइलॉइड-संबंधित बीमारियों जैसे अल्जाइमर रोग और पारिवारिक अमाइलॉइड कार्डियोमायोपैथी या पॉलीन्यूरोपैथी,[20] के साथ-साथ इंट्रासेल्युलर एग्रीगेशन बीमारियों जैसे हंटिंगटन और पार्किंसंस रोग से जुड़े हैं। ये उम्र के साथ होने वाली अपक्षयी बीमारियां गलत तरीके से वलित प्रोटीनों के अघुलनशील, बाह्यकोशिकीय समुच्चय और/या क्रॉस-β अमाइलॉइड फाइब्रिल सहित इंट्रासेल्युलर समावेशन (inclusions) में एकत्रीकरण से जुड़ी हैं। यह पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है कि क्या समुच्चय कारण हैं या केवल प्रोटीन होमियोस्टैसिस के नुकसान का प्रतिबिंब हैं, जो संश्लेषण, वलन, एकत्रीकरण और प्रोटीन टर्नओवर के बीच का संतुलन है। हाल ही में यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी ने मानव अमाइलॉइड रोगों में पोस्ट-मायोटिक ऊतक के अध: पतन के उपचार के लिए टाफामिडिस या विंडाकेल (टेट्रामेरिक ट्रांसथायरेटिन का एक काइनेटिक स्टेबलाइजर) के उपयोग को मंजूरी दी है। यह बताता है कि अमाइलॉइड फाइब्रिल गठन की प्रक्रिया (न कि स्वयं फाइब्रिल) मानव अमाइलॉइड रोगों में ऊतक के अध: पतन का कारण बनती है। वलन और कार्य के बजाय गलत वलन और अत्यधिक गिरावट कई प्रोटीनोपैथी की ओर ले जाती है, जैसे कि एंटीट्रिप्सिन-संबंधित एम्फिसीमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस और लाइसोसोमल स्टोरेज रोग, जहां कार्य की हानि विकार का मूल है। जबकि बाद के विकारों को ठीक करने के लिए ऐतिहासिक रूप से प्रोटीन प्रतिस्थापन चिकित्सा का उपयोग किया गया है, एक उभरता हुआ दृष्टिकोण उत्परिवर्तित प्रोटीनों को कार्यात्मक बनाने के लिए उन्हें वलित करने हेतु फार्मास्युटिकल चैपेरोन का उपयोग करना है।
प्रोटीन वलन के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक तकनीकें
जबकि प्रोटीन वलन के बारे में निष्कर्ष उत्परिवर्तन अध्ययनों के माध्यम से निकाले जा सकते हैं, आमतौर पर, प्रोटीन वलन के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक तकनीकें प्रोटीनों के क्रमिक अनफोल्डिंग या वलन पर निर्भर करती हैं और मानक गैर-क्रिस्टलोग्राफिक तकनीकों का उपयोग करके संरचनात्मक परिवर्तनों का अवलोकन करती हैं।
X-ray crystallography
X-ray crystallography (एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी) मुड़े हुए प्रोटीन की त्रि-आयामी संरचना को समझने का प्रयास करने के लिए सबसे कुशल और महत्वपूर्ण विधियों में से एक है।[21] एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी करने में सक्षम होने के लिए, जांच किए जा रहे प्रोटीन को एक क्रिस्टल लैटिस (क्रिस्टल जालक) के भीतर स्थित होना चाहिए। प्रोटीन को क्रिस्टल लैटिस के भीतर रखने के लिए, किसी के पास क्रिस्टलीकरण के लिए एक उपयुक्त विलायक (सॉल्वेंट) होना चाहिए, घोल में सुपरसैचुरेटेड स्तर पर शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करना चाहिए, और घोल में क्रिस्टल को अवक्षेपित (precipitate) करना चाहिए। एक बार जब प्रोटीन क्रिस्टलीकृत हो जाता है, तो एक्स-रे बीम को क्रिस्टल लैटिस के माध्यम से केंद्रित किया जा सकता है जो बीम को विवर्तित (diffract) करेगा या उन्हें विभिन्न दिशाओं में बाहर की ओर भेजेगा। ये बाहर निकलने वाली बीम भीतर बंद प्रोटीन की विशिष्ट त्रि-आयामी संरचना से संबंधित होती हैं। एक्स-रे विशेष रूप से प्रोटीन क्रिस्टल लैटिस के भीतर व्यक्तिगत परमाणुओं के चारों ओर के इलेक्ट्रॉन बादलों के साथ परस्पर क्रिया करते हैं और एक स्पष्ट विवर्तन पैटर्न उत्पन्न करते हैं। केवल इलेक्ट्रॉन घनत्व बादलों को एक्स-रे के आयाम (amplitude) के साथ जोड़कर ही इस पैटर्न को पढ़ा जा सकता है और इसमें शामिल उन चरणों या फेज कोणों (phase angles) के बारे में धारणाएं बनाई जा सकती हैं जो इस विधि को जटिल बनाते हैं। Fourier transform (फूरियर ट्रांसफॉर्म) नामक गणितीय आधार के माध्यम से स्थापित संबंध के बिना, "phase problem" (फेज समस्या) विवर्तन पैटर्न की भविष्यवाणी करना बहुत कठिन बना देगा। multiple isomorphous replacement जैसी उभरती हुई विधियां एक्स-रे को अधिक पूर्वानुमानित तरीके से विवर्तित करने के लिए भारी धातु आयन की उपस्थिति का उपयोग करती हैं, जिससे इसमें शामिल चर (variables) की संख्या कम हो जाती है और फेज समस्या का समाधान हो जाता है।
Fluorescence spectroscopy
Fluorescence spectroscopy (प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी) प्रोटीन की फोल्डिंग स्थिति का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि है। तीन अमीनो एसिड, फेनिलएलनिन (Phe), टायरोसिन (Tyr) और ट्रिप्टोफैन (Trp), में आंतरिक प्रतिदीप्ति गुण होते हैं, लेकिन केवल Tyr और Trp का उपयोग प्रयोगात्मक रूप से किया जाता है क्योंकि उनकी quantum yield (क्वांटम यील्ड) अच्छी प्रतिदीप्ति संकेत देने के लिए पर्याप्त उच्च होती है। Trp और Tyr दोनों 280 nm की तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्तेजित होते हैं, जबकि केवल Trp 295 nm की तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्तेजित होता है। अपने सुगंधित (aromatic) चरित्र के कारण, Trp और Tyr अवशेष अक्सर प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक कोर में पूरी तरह या आंशिक रूप से दबे हुए, दो प्रोटीन डोमेन के बीच के इंटरफेस पर, या ओलिगोमेरिक प्रोटीन के सबयूनिट्स के बीच के इंटरफेस पर पाए जाते हैं। इस अपोलर वातावरण में, उनकी क्वांटम यील्ड उच्च होती है और इसलिए प्रतिदीप्ति तीव्रता भी उच्च होती है। प्रोटीन की तृतीयक या चतुर्थक संरचना के विघटन पर, ये साइड चेन विलायक के हाइड्रोफिलिक वातावरण के संपर्क में अधिक आ जाते हैं, और उनकी क्वांटम यील्ड कम हो जाती है, जिससे प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती है। Trp अवशेषों के लिए, उनके अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की तरंग दैर्ध्य भी उनके वातावरण पर निर्भर करती है।
प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग डेनचुरेंट मान के कार्यों के रूप में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की तीव्रता या अधिकतम उत्सर्जन की तरंग दैर्ध्य में भिन्नता को मापकर प्रोटीन के equilibrium unfolding (संतुलन अनफोल्डिंग) को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।[22] डेनचुरेंट एक रासायनिक अणु (यूरिया, गुआनिडिनियम हाइड्रोक्लोराइड), तापमान, pH, दबाव आदि हो सकता है। विभिन्न लेकिन अलग-अलग प्रोटीन अवस्थाओं, यानी मूल अवस्था, मध्यवर्ती अवस्थाओं, अनफोल्ड अवस्था के बीच का संतुलन डेनचुरेंट मान पर निर्भर करता है; इसलिए, उनके संतुलन मिश्रण का वैश्विक प्रतिदीप्ति संकेत भी इस मान पर निर्भर करता है। इस प्रकार कोई व्यक्ति डेनचुरेंट मान से वैश्विक प्रोटीन संकेत को जोड़ने वाला एक प्रोफाइल प्राप्त करता है। संतुलन अनफोल्डिंग का प्रोफाइल अनफोल्डिंग के मध्यवर्ती चरणों का पता लगाने और उनकी पहचान करने में सक्षम बना सकता है। ह्यूजेस बेडौएल द्वारा ऐसे प्रोफाइल से होमोमेरिक या हेटेरोमेरिक प्रोटीन के लिए, ट्रिमर और संभावित रूप से टेट्रामर तक, अनफोल्डिंग संतुलन को चिह्नित करने वाले थर्मोडायनामिक पैरामीटर प्राप्त करने के लिए सामान्य समीकरण विकसित किए गए हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी को stopped flow जैसे फास्ट-मिक्सिंग उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है, ताकि प्रोटीन फोल्डिंग कैनेटीक्स को मापा जा सके, chevron plot उत्पन्न किया जा सके और Phi value analysis प्राप्त किया जा सके।
Circular dichroism
মূল নিবন্ধ: Circular dichroism
Circular dichroism (सर्कुलर डाइक्रोइज्म) प्रोटीन फोल्डिंग का अध्ययन करने के लिए सबसे सामान्य और बुनियादी उपकरणों में से एक है। सर्कुलर डाइक्रोइज्म स्पेक्ट्रोस्कोपी सर्कुलर रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश के अवशोषण को मापती है। प्रोटीन में, अल्फा हेलिक्स और beta sheets जैसी संरचनाएं कायरल (chiral) होती हैं, और इसलिए ऐसे प्रकाश को अवशोषित करती हैं। इस प्रकाश का अवशोषण प्रोटीन समूह की फोल्डिंग की डिग्री के मार्कर के रूप में कार्य करता है। इस तकनीक का उपयोग डेनचुरेंट सांद्रता या temperature के कार्य के रूप में इस अवशोषण में परिवर्तन को मापकर प्रोटीन के equilibrium unfolding को मापने के लिए किया गया है। डेनचुरेंट मेल्ट अनफोल्डिंग की मुक्त ऊर्जा के साथ-साथ प्रोटीन के m मान, या डेनचुरेंट निर्भरता को मापता है। तापमान मेल्ट प्रोटीन के डेनचुरेशन तापमान (Tm) को मापता है।[22] प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी की तरह, सर्कुलर-डाइक्रोइज्म स्पेक्ट्रोस्कोपी को प्रोटीन फोल्डिंग कैनेटीक्स को मापने और chevron plot उत्पन्न करने के लिए stopped flow जैसे फास्ट-मिक्सिंग उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है।
Vibrational circular dichroism of proteins
प्रोटीन के लिए vibrational circular dichroism (VCD) तकनीकों के अधिक हालिया विकास, जिसमें वर्तमान में Fourier transform (FT) उपकरण शामिल हैं, बहुत बड़े प्रोटीन अणुओं के लिए भी घोल में प्रोटीन संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए शक्तिशाली साधन प्रदान करते हैं। प्रोटीन के ऐसे VCD अध्ययनों को प्रोटीन क्रिस्टल के लिए X-ray diffraction डेटा, भारी पानी (D2O) में प्रोटीन समाधानों के लिए FT-IR डेटा, या क्वांटम गणनाओं के साथ जोड़ा जा सकता है।
Protein nuclear magnetic resonance spectroscopy
মূল নিবন্ধ: Protein NMR
प्रोटीन nuclear magnetic resonance (NMR) केंद्रित प्रोटीन के नमूनों के माध्यम से एक चुंबकीय क्षेत्र को प्रेरित करके प्रोटीन संरचनात्मक डेटा एकत्र करने में सक्षम है। NMR में, रासायनिक वातावरण के आधार पर, कुछ नाभिक विशिष्ट रेडियो-आवृत्तियों को अवशोषित करेंगे।[23] चूंकि प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तन ns से ms तक के समय के पैमाने पर काम करते हैं, NMR ps से s के समय के पैमाने पर मध्यवर्ती संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से सुसज्जित है। प्रोटीन संरचना और गैर-फोल्डिंग प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए कुछ मुख्य तकनीकों में COSY, TOCSY, HSQC, टाइम रिलैक्सेशन (T1 और T2), और NOE शामिल हैं। NOE विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि स्थानिक रूप से निकटवर्ती हाइड्रोजनों के बीच चुंबकत्व हस्तांतरण (magnetization transfers) देखे जा सकते हैं। विभिन्न NMR प्रयोगों में समय-पैमाने की संवेदनशीलता की अलग-अलग डिग्री होती है जो विभिन्न प्रोटीन संरचनात्मक परिवर्तनों के लिए उपयुक्त होती है। NOE बॉन्ड कंपन या साइड चेन रोटेशन को पकड़ सकता है, हालांकि, NOE प्रोटीन फोल्डिंग को पकड़ने के लिए बहुत संवेदनशील है क्योंकि यह बड़े समय के पैमाने पर होता है।
चूंकि प्रोटीन फोल्डिंग लगभग 50 से 3000 s−1 में होती है, CPMG रिलैक्सेशन डिस्पर्शन और केमिकल एक्सचेंज सैचुरेशन ट्रांसफर फोल्डिंग के NMR विश्लेषण के लिए प्राथमिक तकनीकों में से कुछ बन गए हैं।[24] इसके अलावा, दोनों तकनीकों का उपयोग प्रोटीन फोल्डिंग परिदृश्य में उत्तेजित मध्यवर्ती अवस्थाओं को उजागर करने के लिए किया जाता है। ऐसा करने के लिए, CPMG रिलैक्सेशन डिस्पर्शन spin echo घटना का लाभ उठाता है। यह तकनीक लक्ष्य नाभिक को 90 पल्स और उसके बाद एक या अधिक 180 पल्स के संपर्क में लाती है। जैसे ही नाभिक फिर से फोकस करते हैं, एक व्यापक वितरण यह इंगित करता है कि लक्ष्य नाभिक एक मध्यवर्ती उत्तेजित अवस्था में शामिल है। रिलैक्सेशन डिस्पर्शन प्लॉट को देखकर डेटा उत्तेजित और जमीनी अवस्था के बीच थर्मोडायनामिक्स और कैनेटीक्स पर जानकारी एकत्र करता है। सैचुरेशन ट्रांसफर जमीनी अवस्था से संकेत में परिवर्तन को मापता है क्योंकि उत्तेजित अवस्थाएं परेशान हो जाती हैं। यह किसी विशेष नाभिक की उत्तेजित अवस्था को संतृप्त करने के लिए कमजोर रेडियो आवृत्ति विकिरण का उपयोग करता है जो अपनी संतृप्ति को जमीनी अवस्था में स्थानांतरित कर देता है। यह संकेत जमीनी अवस्था के चुंबकत्व (और संकेत) को कम करके प्रवर्धित किया जाता है।
NMR में मुख्य सीमाएं यह हैं कि इसका रिज़ॉल्यूशन 25 kDa से बड़े प्रोटीन के साथ कम हो जाता है और यह X-ray crystallography जितना विस्तृत नहीं है।[24] इसके अतिरिक्त, प्रोटीन NMR विश्लेषण काफी कठिन है और एक ही NMR स्पेक्ट्रम से कई समाधान प्रस्तावित कर सकता है।
अमीओट्रोफिक लैटरल स्क्लेरोसिस (ALS) से संबंधित प्रोटीन SOD1 के फोल्डिंग पर केंद्रित एक अध्ययन में, रिलैक्सेशन डिस्पर्शन (relaxation dispersion) और सैचुरेशन ट्रांसफर (saturation transfer) का उपयोग करके उत्तेजित मध्यवर्ती अवस्थाओं (excited intermediates) का अध्ययन किया गया।[25] SOD1 को पहले कई रोग पैदा करने वाले म्यूटेंट से जोड़ा गया था, जिनके बारे में माना जाता था कि वे प्रोटीन एग्रीगेशन (एकत्रीकरण) में शामिल हैं, हालाँकि इसकी क्रियाविधि अभी भी अज्ञात थी। रिलैक्सेशन डिस्पर्शन और सैचुरेशन ट्रांसफर प्रयोगों का उपयोग करके, SOD1 म्यूटेंट में मिसफोल्डिंग की कई उत्तेजित मध्यवर्ती अवस्थाओं का पता चला।
डुअल-पोलराइजेशन इंटरफेरोमेट्री
মূল নিবন্ধ: Dual-polarization interferometry डुअल पोलराइजेशन इंटरफेरोमेट्री आणविक परतों के ऑप्टिकल गुणों को मापने के लिए एक सतह-आधारित तकनीक है। जब इसका उपयोग प्रोटीन फोल्डिंग को चिह्नित करने के लिए किया जाता है, तो यह वास्तविक समय में उप-एंगस्ट्रॉम (sub-Angstrom) रिज़ॉल्यूशन पर प्रोटीन की एक मोनोलेयर के कुल आकार और उसके घनत्व को निर्धारित करके कन्फर्मेशन को मापता है,[26] हालाँकि प्रोटीन फोल्डिंग की गतिशीलता का वास्तविक समय में मापन उन प्रक्रियाओं तक सीमित है जो ~10 Hz से धीमी गति से होती हैं। सर्कुलर डाइक्रोइज्म के समान, फोल्डिंग के लिए उत्तेजना एक डिनेचुरेंट (denaturant) या तापमान हो सकती है।
उच्च समय रिज़ॉल्यूशन के साथ फोल्डिंग का अध्ययन
हाल के वर्षों में तेज़, समय-समाधान (time-resolved) तकनीकों के विकास से प्रोटीन फोल्डिंग के अध्ययन में काफी प्रगति हुई है। प्रयोगकर्ता तेजी से अनफोल्डेड प्रोटीन के नमूने की फोल्डिंग को ट्रिगर करते हैं और परिणामी गतिशीलता का निरीक्षण करते हैं। उपयोग की जाने वाली तेज़ तकनीकों में समाधानों का अल्ट्राफास्ट मिश्रण, फोटोकैमिकल विधियाँ और लेजर तापमान जंप स्पेक्ट्रोस्कोपी शामिल हैं। इन तकनीकों के विकास में योगदान देने वाले कई वैज्ञानिकों में हेनरिक रोडर, टेरी ओस, हैरी ग्रे, मार्टिन ग्रुबेले, ब्रायन डायर, विलियम ईटन, शीना रेडफोर्ड, क्रिस डॉब्सन, एलन फेर्श्ट, बेंग्ट नोलटिंग और लार्स कोनरमैन शामिल हैं।
प्रोटीयोलिसिस
प्रोटीयोलिसिस का उपयोग नियमित रूप से समाधान की स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत अनफोल्डेड अंश की जांच करने के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए, फास्ट पैरेलल प्रोटीयोलिसिस (FASTpp))।[27]
सिंगल-मॉलिक्यूल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी
ऑप्टिकल ट्वीज़र और AFM जैसी सिंगल-मॉलिक्यूल तकनीकों का उपयोग अलग-थलग प्रोटीनों के साथ-साथ चैपरोन्स (chaperones) वाले प्रोटीनों की फोल्डिंग क्रियाविधि को समझने के लिए किया गया है।[28] ऑप्टिकल ट्वीज़र का उपयोग एकल प्रोटीन अणुओं को उनके C- और N-टर्मिनी से खींचने और उन्हें अनफोल्ड करने के लिए किया गया है ताकि बाद की रिफोल्डिंग का अध्ययन किया जा सके। यह तकनीक सिंगल-मॉलिक्यूल स्तर पर फोल्डिंग दरों को मापने की अनुमति देती है; उदाहरण के लिए, हाल ही में रक्त के थक्के जमने में शामिल प्रोटीनों की फोल्डिंग और अनफोल्डिंग का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र का उपयोग किया गया है। वॉन विलेब्रांड फैक्टर (vWF) एक ऐसा प्रोटीन है जिसकी रक्त के थक्के जमने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका होती है। सिंगल-मॉलिक्यूल ऑप्टिकल ट्वीज़र मापन का उपयोग करके यह पता चला कि कैल्शियम-युक्त vWF रक्त में शियर फोर्स (कतरनी बल) सेंसर के रूप में कार्य करता है। शियर फोर्स vWF के A2 डोमेन के अनफोल्डिंग की ओर ले जाता है, जिसकी रिफोल्डिंग दर कैल्शियम की उपस्थिति में नाटकीय रूप से बढ़ जाती है। यह भी दिखाया गया है कि सरल src SH3 डोमेन बल के तहत कई अनफोल्डिंग मार्गों तक पहुँचता है।
बायोटिन पेंटिंग
बायोटिन पेंटिंग (Biotin painting) (अन)फोल्डेड प्रोटीनों के स्थिति-विशिष्ट सेलुलर स्नैपशॉट को सक्षम बनाती है। बायोटिन 'पेंटिंग' अनुमानित इंट्रिन्सिकली डिसऑर्डर्ड प्रोटीन्स की ओर झुकाव दिखाती है।[29]
प्रोटीन फोल्डिंग के कम्प्यूटेशनल अध्ययन
प्रोटीन फोल्डिंग के कम्प्यूटेशनल अध्ययन में प्रोटीन स्थिरता, गतिशीलता और संरचना के पूर्वानुमान से संबंधित तीन मुख्य पहलू शामिल हैं। 2013 की एक समीक्षा प्रोटीन फोल्डिंग के लिए उपलब्ध कम्प्यूटेशनल विधियों का सारांश प्रस्तुत करती है। [30]
लेविन्थल का विरोधाभास
1969 में, साइरस लेविन्थल ने उल्लेख किया कि, अनफोल्डेड पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में स्वतंत्रता की बहुत अधिक डिग्री होने के कारण, अणु में संभावित कन्फर्मेशन की एक खगोलीय संख्या होती है। उनके एक शोध पत्र में 3^300 या 10^143 का अनुमान लगाया गया था।[31] लेविन्थल का विरोधाभास इस अवलोकन पर आधारित एक विचार प्रयोग है कि यदि किसी प्रोटीन को सभी संभावित कन्फर्मेशन के क्रमिक नमूने द्वारा फोल्ड किया जाता, तो ऐसा करने में खगोलीय समय लगता, भले ही कन्फर्मेशन को तीव्र दर (नैनोसेकंड या पिकोसेकंड पैमाने पर) पर नमूना लिया जाता। इस अवलोकन के आधार पर कि प्रोटीन इससे कहीं अधिक तेज़ी से फोल्ड होते हैं, लेविन्थल ने तब प्रस्तावित किया कि एक यादृच्छिक कन्फर्मेशनल खोज नहीं होती है, और इसलिए, प्रोटीन को मेटा-स्टेबल मध्यवर्ती अवस्थाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से फोल्ड होना चाहिए।
प्रोटीन फोल्डिंग का ऊर्जा परिदृश्य
फोल्डिंग के दौरान प्रोटीन के कॉन्फ़िगरेशन स्पेस को एक ऊर्जा परिदृश्य के रूप में देखा जा सकता है। जोसेफ ब्रिंगेलसन और पीटर वोलाइन्स के अनुसार, प्रोटीन 'न्यूनतम निराशा के सिद्धांत' (principle of minimal frustration) का पालन करते हैं, जिसका अर्थ है कि प्राकृतिक रूप से विकसित प्रोटीनों ने अपने फोल्डिंग ऊर्जा परिदृश्यों को अनुकूलित किया है,[32] और प्रकृति ने अमीनो एसिड अनुक्रमों को इस तरह चुना है कि प्रोटीन की फोल्डेड अवस्था पर्याप्त रूप से स्थिर हो। इसके अलावा, फोल्डेड अवस्था का अधिग्रहण एक पर्याप्त तेज़ प्रक्रिया बन गया। भले ही प्रकृति ने प्रोटीनों में 'निराशा' (frustration) के स्तर को कम कर दिया है, फिर भी इसका कुछ अंश अब तक बना हुआ है, जैसा कि प्रोटीन के ऊर्जा परिदृश्य में स्थानीय मिनिमा की उपस्थिति में देखा जा सकता है।
इन विकासवादी रूप से चयनित अनुक्रमों का एक परिणाम यह है कि आमतौर पर यह माना जाता है कि प्रोटीनों में वैश्विक रूप से "फनल ऊर्जा परिदृश्य" (जोस ओनुचिक द्वारा गढ़ा गया शब्द) होते हैं[33] जो काफी हद तक मूल अवस्था (native state) की ओर निर्देशित होते हैं। यह "फोल्डिंग फ़नल" परिदृश्य प्रोटीन को एक एकल तंत्र तक सीमित रहने के बजाय, बड़ी संख्या में मार्गों और मध्यवर्ती अवस्थाओं में से किसी के माध्यम से मूल अवस्था में फोल्ड होने की अनुमति देता है। यह सिद्धांत मॉडल प्रोटीनों के कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन और प्रायोगिक अध्ययनों दोनों द्वारा समर्थित है, और इसका उपयोग प्रोटीन संरचना पूर्वानुमान और डिज़ाइन के तरीकों को बेहतर बनाने के लिए किया गया है। लेवेलिंग फ्री-एनर्जी परिदृश्य द्वारा प्रोटीन फोल्डिंग का विवरण ऊष्मागतिकी के दूसरे नियम के अनुरूप भी है। भौतिक रूप से, परिदृश्यों को विज़ुअलाइज़ करने योग्य क्षमता या कुल ऊर्जा सतहों के संदर्भ में सोचना, जिसमें केवल मैक्सिमा, सैडल पॉइंट्स, मिनिमा और फ़नल हों, भौगोलिक परिदृश्यों की तरह, शायद थोड़ा भ्रामक है। प्रासंगिक विवरण वास्तव में एक उच्च-आयामी चरण स्थान (phase space) है जिसमें मैनिफोल्ड्स कई तरह के अधिक जटिल टोपोलॉजिकल रूप ले सकते हैं।
अविस्तारित पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला फ़नल (कीप) के शीर्ष पर शुरू होती है जहाँ यह सबसे अधिक संख्या में अविस्तारित विविधताओं को ग्रहण कर सकती है और अपनी उच्चतम ऊर्जा अवस्था में होती है। इस तरह के ऊर्जा परिदृश्य (energy landscapes) दर्शाते हैं कि प्रारंभिक संभावनाओं की एक बड़ी संख्या है, लेकिन केवल एक ही मूल अवस्था (native state) संभव है; हालाँकि, यह उन अनेक फोल्डिंग मार्गों को प्रकट नहीं करता है जो संभव हैं। एक ही सटीक प्रोटीन का एक अलग अणु मामूली रूप से भिन्न फोल्डिंग मार्गों का अनुसरण करने में सक्षम हो सकता है, जो विभिन्न निम्न-ऊर्जा मध्यवर्तियों की तलाश करता है, बशर्ते कि समान मूल संरचना प्राप्त हो जाए।[34] प्रत्येक मार्ग की ऊष्मागतिक अनुकूलता (thermodynamic favorability) के आधार पर विभिन्न मार्गों के उपयोग की आवृत्ति अलग-अलग हो सकती है। इसका अर्थ यह है कि यदि कोई एक मार्ग दूसरे की तुलना में अधिक ऊष्मागतिक रूप से अनुकूल पाया जाता है, तो मूल संरचना की खोज में इसका उपयोग अधिक बार किए जाने की संभावना है। जैसे-जैसे प्रोटीन फोल्ड होना शुरू होता है और अपने विभिन्न संरूपणों (conformations) को ग्रहण करता है, यह हमेशा पहले की तुलना में अधिक ऊष्मागतिक रूप से अनुकूल संरचना की तलाश करता है और इस प्रकार ऊर्जा फ़नल के माध्यम से आगे बढ़ता रहता है। द्वितीयक संरचनाओं का निर्माण प्रोटीन के भीतर बढ़ी हुई स्थिरता का एक मजबूत संकेत है, और पॉलीपेप्टाइड बैकबोन द्वारा ग्रहण की गई द्वितीयक संरचनाओं का केवल एक संयोजन ही सबसे कम ऊर्जा वाला होगा और इसलिए प्रोटीन की मूल अवस्था में मौजूद होगा। पॉलीपेप्टाइड के फोल्ड होना शुरू होने के बाद बनने वाली पहली संरचनाओं में अल्फा हेलिक्स और बीटा टर्न शामिल हैं, जहाँ अल्फा हेलिक्स 100 नैनोसेकंड और बीटा टर्न 1 माइक्रोसेकंड जितने कम समय में बन सकते हैं।
ऊर्जा फ़नल परिदृश्य में एक सैडल पॉइंट (saddle point) मौजूद होता है जहाँ किसी विशेष प्रोटीन के लिए संक्रमण अवस्था (transition state) पाई जाती है।[14] ऊर्जा फ़नल आरेख में संक्रमण अवस्था वह संरूपण है जिसे उस प्रोटीन के प्रत्येक अणु द्वारा ग्रहण किया जाना चाहिए यदि प्रोटीन अंततः मूल संरचना को ग्रहण करना चाहता है। कोई भी प्रोटीन संक्रमण अवस्था से गुजरे बिना मूल संरचना को ग्रहण नहीं कर सकता है। संक्रमण अवस्था को केवल एक और मध्यवर्ती चरण के बजाय मूल अवस्था के एक प्रकार या समयपूर्व रूप के रूप में संदर्भित किया जा सकता है। संक्रमण अवस्था की फोल्डिंग दर-निर्धारक (rate-determining) दिखाई गई है, और भले ही यह मूल फोल्ड की तुलना में उच्च ऊर्जा अवस्था में मौजूद हो, यह मूल संरचना से काफी मिलती-जुलती है। संक्रमण अवस्था के भीतर, एक केंद्रक (nucleus) मौजूद होता है जिसके चारों ओर प्रोटीन फोल्ड होने में सक्षम होता है, जो "न्यूक्लिएशन कंडेनसेशन" नामक प्रक्रिया द्वारा बनता है जहाँ संरचना केंद्रक पर ढहने लगती है।
प्रोटीन फोल्डिंग की मॉडलिंग
कंप्यूटेशनल प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी के लिए डी नोवो (De novo) या ab initio तकनीकों का उपयोग प्रोटीन फोल्डिंग के विभिन्न पहलुओं के अनुकरण के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन फोल्डिंग का सबसे पहला कंप्यूटर सिमुलेशन 1975 में लेविट और वारशेल (Nature 1975) द्वारा किया गया था, जिसने फोल्डिंग पथ तैयार किए[35] जो फोल्ड की गई संरचना के करीब एक संरचना में ढह गए और मूल रूप से लेवेन्थल विरोधाभास का एक "समाधान" प्रदान किया। सिमुलेशन में एक सामान्य मोड उपचार भी शामिल था जिसने फोल्डिंग प्रक्रिया के कुछ गतिशील पहलुओं का पता लगाया। आणविक गतिशीलता (Molecular dynamics - MD) का उपयोग इन सिलिको (in silico) प्रोटीन फोल्डिंग और गतिशीलता के सिमुलेशन में किया गया था। पहले संतुलन फोल्डिंग सिमुलेशन निहित विलायक मॉडल (implicit solvent model) और अम्ब्रेला सैंपलिंग का उपयोग करके किए गए थे। कम्प्यूटेशनल लागत के कारण, स्पष्ट पानी (explicit water) के साथ ab initio MD फोल्डिंग सिमुलेशन पेप्टाइड्स और छोटे प्रोटीन तक सीमित हैं। बड़े प्रोटीन के MD सिमुलेशन प्रयोगात्मक संरचना की गतिशीलता या इसके उच्च-तापमान अनफोल्डिंग तक सीमित रहते हैं। लंबे समय तक चलने वाली फोल्डिंग प्रक्रियाएं (लगभग 1 मिलीसेकंड से अधिक), जैसे कि बड़े प्रोटीन (>150 अवशेष) की फोल्डिंग, को कोर्स-ग्रेन्ड मॉडल का उपयोग करके एक्सेस किया जा सकता है।
कई बड़े पैमाने की कम्प्यूटेशनल परियोजनाएं, जैसे Rosetta@home,[36] Folding@home और Foldit, प्रोटीन फोल्डिंग को लक्षित करती हैं।
लंबे निरंतर-प्रक्षेपवक्र सिमुलेशन एंटोन पर किए गए हैं, जो D. E. Shaw Research द्वारा कस्टम ASICs और इंटरकनेक्ट्स के चारों ओर डिज़ाइन और निर्मित एक बड़े पैमाने पर समानांतर सुपरकंप्यूटर है। 2011 तक एंटोन का उपयोग करके किए गए सिमुलेशन का सबसे लंबा प्रकाशित परिणाम 355 K पर NTL9 का 2.936 मिलीसेकंड का सिमुलेशन था।[37] इस तरह के सिमुलेशन वर्तमान में संतुलन में छोटे प्रोटीन (<150 अमीनो एसिड अवशेष) को अनफोल्ड और रिफोल्ड करने और यह अनुमान लगाने में सक्षम हैं कि उत्परिवर्तन (mutations) फोल्डिंग कैनेटीक्स और स्थिरता को कैसे प्रभावित करते हैं।
2020 में शोधकर्ताओं की एक टीम ने AlphaFold का उपयोग किया, जो DeepMind द्वारा विकसित एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (AI) प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी कार्यक्रम है, जिसने CASP में पहला स्थान प्राप्त किया, जो एक लंबे समय से चली आ रही संरचना भविष्यवाणी प्रतियोगिता है।[38] टीम ने किसी भी अन्य समूह की तुलना में बहुत अधिक सटीकता का स्तर हासिल किया। इसने CASP के ग्लोबल डिस्टेंस टेस्ट (GDT) में लगभग दो-तिहाई प्रोटीन के लिए 90% से अधिक स्कोर किया, एक ऐसा परीक्षण जो कम्प्यूटेशनल प्रोग्राम द्वारा अनुमानित संरचना और प्रयोगशाला में प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित अनुभवजन्य संरचना के बीच समानता की डिग्री को मापता है। GDT की गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले दूरी कटऑफ के भीतर, 100 के स्कोर को पूर्ण मिलान माना जाता है।
CASP में अल्फाफोल्ड के प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी परिणामों को "परिवर्तनकारी" और "आश्चर्यजनक" के रूप में वर्णित किया गया था।[39] कुछ शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि सटीकता इसकी एक तिहाई भविष्यवाणियों के लिए पर्याप्त उच्च नहीं है, और यह प्रोटीन फोल्डिंग समस्या के हल होने के लिए प्रोटीन फोल्डिंग के भौतिक तंत्र को प्रकट नहीं करती है। फिर भी, इसे कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी में एक महत्वपूर्ण उपलब्धि और जीव विज्ञान की दशकों पुरानी बड़ी चुनौती, प्रोटीन की संरचना की भविष्यवाणी करने की दिशा में बड़ी प्रगति माना जाता है।
संदर्भ
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स्रोत: अंग्रेज़ी विकिपीडिया के “Protein folding” लेख का अनुवाद। मूल लेख: https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_folding यह अनुवाद स्वचालित रूप से तैयार किया गया है।
