ELISA
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| meshid | D004797 |
एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉरबेंट एसे (ELISA) (IPA: /ᵻˈlaɪzə/, IPA: /ˌiːˈlaɪzə/) एक आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला विश्लेषणात्मक जैव रसायन परख है, जिसका वर्णन पहली बार 1971 में ईवा एंगवाल और पीटर पर्लमैन द्वारा किया गया था।[1] यह परख एक तरल नमूने में लिगैंड (आमतौर पर एक प्रोटीन) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एंजाइम इम्यूनोएसे (EIA) का एक ठोस-चरण प्रकार है, जिसमें मापे जाने वाले लिगैंड के विरुद्ध निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। ELISA का उपयोग चिकित्सा, पादप रोग विज्ञान, और जैव प्रौद्योगिकी में एक नैदानिक उपकरण के रूप में, साथ ही विभिन्न उद्योगों में गुणवत्ता नियंत्रण जांच के रूप में किया गया है।
ELISA के सबसे सरल रूप में, परीक्षण किए जाने वाले नमूने से एंटीजन को एक सतह से जोड़ा जाता है। फिर, सतह पर एक मिलान करने वाली एंटीबॉडी लगाई जाती है ताकि वह एंटीजन से जुड़ सके। यह एंटीबॉडी एक एंजाइम से जुड़ी होती है, और फिर किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। अंतिम चरण में, एंजाइम के सबस्ट्रेट युक्त एक पदार्थ को जोड़ा जाता है। यदि बाइंडिंग हुई थी, तो बाद की प्रतिक्रिया एक पता लगाने योग्य संकेत उत्पन्न करती है, जो आमतौर पर रंग परिवर्तन होता है।
ELISA करने में एक विशेष एंटीजन के लिए विशिष्टता वाली कम से कम एक एंटीबॉडी शामिल होती है। एंटीजन की अज्ञात मात्रा वाले नमूने को ठोस समर्थन (आमतौर पर एक पॉलीस्टाइनिन माइक्रोटाइटर प्लेट) पर या तो गैर-विशिष्ट रूप से (सतह पर अधिशोषण के माध्यम से) या विशिष्ट रूप से (उसी एंटीजन के लिए विशिष्ट एक अन्य एंटीबॉडी द्वारा कैप्चर के माध्यम से, "सैंडविच" ELISA में) स्थिर किया जाता है। एंटीजन के स्थिर होने के बाद, डिटेक्शन एंटीबॉडी को जोड़ा जाता है, जो एंटीजन के साथ एक कॉम्प्लेक्स बनाता है। डिटेक्शन एंटीबॉडी को सहसंयोजक रूप से एक एंजाइम से जोड़ा जा सकता है या इसे स्वयं एक सेकेंडरी एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जा सकता है जो बायोकंजुगेशन के माध्यम से एक एंजाइम से जुड़ी होती है। प्रत्येक चरण के बीच, प्लेट को आमतौर पर किसी भी प्रोटीन या एंटीबॉडी को हटाने के लिए एक हल्के डिटर्जेंट समाधान के साथ धोया जाता है जो गैर-विशिष्ट रूप से बंधे होते हैं। अंतिम धुलाई चरण के बाद, प्लेट को एक दृश्य संकेत उत्पन्न करने के लिए एक एंजाइमेटिक सबस्ट्रेट जोड़कर विकसित किया जाता है, जो नमूने में एंटीजन की मात्रा को इंगित करता है।
ध्यान देने योग्य बात यह है कि ELISA सख्ती से "इम्यूनो" एसे के बजाय लिगैंड बाइंडिंग एसे के अन्य रूपों को भी कर सकता है, हालांकि इस नाम ने इस पद्धति के सामान्य उपयोग और विकास के इतिहास के कारण मूल "इम्यूनो" शब्द को बरकरार रखा है। तकनीक को अनिवार्य रूप से किसी भी लिगेटिंग अभिकर्मक की आवश्यकता होती है जिसे ठोस चरण पर स्थिर किया जा सके, साथ ही एक डिटेक्शन अभिकर्मक जो विशिष्ट रूप से बंधेगा और एक संकेत उत्पन्न करने के लिए एंजाइम का उपयोग करेगा जिसे ठीक से मापा जा सके। धुलाई के बीच, केवल लिगैंड और उसके विशिष्ट बाइंडिंग समकक्ष ही ठोस चरण पर एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन द्वारा विशिष्ट रूप से बंधे या "इम्यूनोसॉरब्ड" रहते हैं, जबकि गैर-विशिष्ट या अनबाउंड घटक धुल जाते हैं। अन्य स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक वेट लैब एसे प्रारूपों के विपरीत जहां धुलाई के बाद उसी प्रतिक्रिया कुएं (जैसे, एक क्यूवेट) का पुन: उपयोग किया जा सकता है, ELISA प्लेटों में प्रतिक्रिया उत्पाद ठोस चरण पर इम्यूनोसॉरब्ड होते हैं, जो प्लेट का हिस्सा होते हैं और इसलिए आसानी से पुन: प्रयोज्य नहीं होते हैं।
सिद्धांत
एक विश्लेषणात्मक जैव रसायन परख और एक "वेट लैब" तकनीक के रूप में, ELISA में एक तरल नमूने में एक विश्लेष्य (analyte) (अर्थात, वह विशिष्ट पदार्थ जिसकी उपस्थिति का मात्रात्मक या गुणात्मक रूप से विश्लेषण किया जा रहा है) का पता लगाना शामिल है, एक ऐसी विधि द्वारा जो विश्लेषण के दौरान तरल अभिकर्मकों का उपयोग करना जारी रखती है (अर्थात, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का नियंत्रित अनुक्रम जो एक संकेत उत्पन्न करेगा जिसे आसानी से मापा जा सकता है और नमूने में विश्लेष्य की मात्रा के माप के रूप में व्याख्या की जा सकती है) जो तरल रहता है और प्रतिक्रिया कक्ष या कुएं के अंदर रहता है जिसे अभिकर्मकों को निहित रखने की आवश्यकता होती है।[2] यह "ड्राई लैब" तकनीकों के विपरीत है जो सूखी पट्टियों का उपयोग करती हैं। भले ही नमूना तरल हो (जैसे, एक मापी गई छोटी बूंद), "ड्राई" विश्लेषण में अंतिम पता लगाने के चरण में रिफ्लेक्टोमेट्री जैसी विधियों द्वारा एक सूखी पट्टी को पढ़ना शामिल है और इसमें स्पिलओवर या नमूनों के बीच मिश्रण को रोकने के लिए प्रतिक्रिया नियंत्रण कक्ष की आवश्यकता नहीं होती है।
एक विषम परख के रूप में, ELISA विश्लेषणात्मक प्रतिक्रिया मिश्रण के कुछ घटकों को कुछ घटकों को एक ठोस चरण पर अधिशोषित करके अलग करता है जो भौतिक रूप से स्थिर होता है। ELISA में, एक तरल नमूने को विशेष बाइंडिंग गुणों वाले एक स्थिर ठोस चरण पर जोड़ा जाता है और इसके बाद कई तरल अभिकर्मक आते हैं जिन्हें क्रमिक रूप से जोड़ा, इनक्यूबेट और धोया जाता है, जिसके बाद कुएं में अंतिम तरल में कुछ ऑप्टिकल परिवर्तन (जैसे, एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के उत्पाद द्वारा रंग विकास) होता है जिससे विश्लेष्य की मात्रा मापी जाती है। मात्रात्मक "रीडिंग" आमतौर पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रेषित प्रकाश की तीव्रता का पता लगाने पर आधारित होती है, जिसमें मल्टी-वेल प्लेट प्रारूप में कुएं के पारदर्शी तल के साथ-साथ तरल के माध्यम से प्रकाश की कुछ विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के संचरण का परिमाणीकरण शामिल होता है।[2] पता लगाने की संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक प्रतिक्रियाओं के दौरान संकेत के प्रवर्धन पर निर्भर करती है। चूंकि एंजाइम प्रतिक्रियाएं बहुत अच्छी तरह से ज्ञात प्रवर्धन प्रक्रियाएं हैं, संकेत उन एंजाइमों द्वारा उत्पन्न होता है जो सटीक परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए निश्चित अनुपात में डिटेक्शन अभिकर्मकों से जुड़े होते हैं, और इसलिए इसका नाम "एंजाइम-लिंक्ड" है।
विश्लेष्य को लिगैंड भी कहा जाता है क्योंकि यह विशेष रूप से एक डिटेक्शन अभिकर्मक से बंधेगा या लिगेट करेगा, इस प्रकार ELISA लिगैंड बाइंडिंग एसे की बड़ी श्रेणी के अंतर्गत आता है।[2] लिगैंड-विशिष्ट बाइंडिंग अभिकर्मक "स्थिर" होता है, यानी, आमतौर पर एक कुएं के पारदर्शी तल और कभी-कभी साइड वॉल पर लेपित और सुखाया जाता है (यहाँ स्थिर "ठोस चरण"/"ठोस सबस्ट्रेट" ठोस माइक्रोपार्टिकल/मोतियों के विपरीत जिन्हें धोया जा सकता है), जिसे आमतौर पर "ELISA प्लेट" के रूप में जानी जाने वाली मल्टी-वेल प्लेट के रूप में निर्मित किया जाता है। पारंपरिक रूप से, इम्यूनोएसे के अन्य रूपों की तरह, एंटीजन-एंटीबॉडी प्रकार की प्रतिक्रिया की विशिष्टता का उपयोग किया जाता है क्योंकि अभिकर्मक के रूप में थोक में एंटीजन के खिलाफ विशेष रूप से एंटीबॉडी बढ़ाना आसान होता है। वैकल्पिक रूप से, यदि विश्लेष्य स्वयं एक एंटीबॉडी है, तो इसके लक्ष्य एंटीजन का उपयोग बाइंडिंग अभिकर्मक के रूप में किया जा सकता है।
इतिहास
ELISA के विकास से पहले, इम्यूनोएसे आयोजित करने का एकमात्र विकल्प रेडियोइम्यूनोएसे था, जो रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए एंटीजन या एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली एक तकनीक थी। रेडियोइम्यूनोएसे में, रेडियोधर्मिता संकेत प्रदान करती है, जो यह इंगित करती है कि नमूने में कोई विशिष्ट एंटीजन या एंटीबॉडी मौजूद है या नहीं। रेडियोइम्यूनोएसे का वर्णन पहली बार 1960 में प्रकाशित रोजालिन सुस्मान यालो और सोलोमन बर्सन के एक वैज्ञानिक पत्र में किया गया था।[3]
चूंकि रेडियोधर्मिता एक संभावित स्वास्थ्य खतरा पैदा करती है, इसलिए एक सुरक्षित विकल्प की तलाश की गई। रेडियोइम्यूनोएसे का एक उपयुक्त विकल्प रेडियोधर्मी संकेत के स्थान पर एक गैर-रेडियोधर्मी संकेत को प्रतिस्थापित करेगा। जब एंजाइम (जैसे हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) उपयुक्त सबस्ट्रेट्स (जैसे ABTS या TMB) के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, तो रंग में परिवर्तन होता है, जिसका उपयोग संकेत के रूप में किया जाता है। हालांकि, संकेत को एंटीबॉडी या एंटीजन की उपस्थिति से जोड़ा जाना चाहिए, यही कारण है कि एंजाइम को एक उपयुक्त एंटीबॉडी से जोड़ा जाना चाहिए। यह लिंकिंग प्रक्रिया स्वतंत्र रूप से स्ट्रेटिस अवरामस और जी. बी. पियर्स द्वारा विकसित की गई थी।[4] चूंकि धुलाई द्वारा किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी या एंटीजन को हटाना आवश्यक है, इसलिए एंटीबॉडी या एंटीजन को कंटेनर की सतह पर तय किया जाना चाहिए; यानी, इम्यूनोसॉरबेंट तैयार किया जाना चाहिए। इसे पूरा करने के लिए एक तकनीक वाइड और जर्कर पोराथ द्वारा 1966 में प्रकाशित की गई थी।
1971 में, स्वीडन में स्टॉकहोम विश्वविद्यालय के पीटर पर्लमैन और ईवा एंगवाल, और नीदरलैंड में एंटोन शुर्स और बाउके वैन वीमेन ने स्वतंत्र रूप से ऐसे शोध पत्र प्रकाशित किए जिन्होंने इस ज्ञान को EIA/ELISA करने के तरीकों में संश्लेषित किया।[5]
पारंपरिक ELISA में आमतौर पर क्रोमोजेनिक (वर्णोत्पादक) रिपोर्टर और सबस्ट्रेट शामिल होते हैं जो एंटीजन या एनालाइट की उपस्थिति को इंगित करने के लिए कुछ दृश्य रंग परिवर्तन उत्पन्न करते हैं। नई ELISA-जैसी तकनीकें मापने योग्य संकेत बनाने के लिए फ्लोरोजेनिक, इलेक्ट्रोकेमिलुमिनेसेंट, और मात्रात्मक पीसीआर (quantitative PCR) रिपोर्टर का उपयोग करती हैं। इन नए रिपोर्टरों के कई लाभ हो सकते हैं, जिनमें उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता (sensitivity and specificity) और मल्टीप्लेक्सिंग शामिल हैं।[6] तकनीकी शब्दों में, इस प्रकार के नए एसे (assays) सख्ती से ELISA नहीं हैं, क्योंकि वे "एंजाइम-लिंक्ड" नहीं होते हैं, बल्कि किसी गैर-एंजाइमी रिपोर्टर से जुड़े होते हैं। हालाँकि, यह देखते हुए कि इन एसे में सामान्य सिद्धांत काफी हद तक समान हैं, उन्हें अक्सर ELISA के समान श्रेणी में रखा जाता है।
2012 में, नैनोपार्टिकल का क्रोमोजेनिक रिपोर्टर के रूप में उपयोग करने वाला एक अल्ट्रासेंसिटिव, एंजाइम-आधारित ELISA परीक्षण, केवल एट्टोग्राम (attograms) एनालाइट का पता लगाकर नग्न आंखों से दिखने वाला रंग संकेत देने में सक्षम था। सकारात्मक परिणामों के लिए नीला रंग और नकारात्मक के लिए लाल रंग दिखाई देता है। ध्यान दें कि यह पता लगाना केवल एनालाइट की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि कर सकता है, वास्तविक सांद्रता की नहीं।[7]
प्रकार
विशिष्ट अणुओं के लिए कई ELISA परीक्षण हैं जो मिलान करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं। एनालाइट्स और एंटीबॉडी कैसे बंधे हैं और उपयोग किए जाते हैं, इसके आधार पर ELISA परीक्षणों को कई प्रकार के परीक्षणों में विभाजित किया गया है।[8] प्रमुख प्रकारों का वर्णन यहाँ किया गया है।
प्रत्यक्ष (Direct)
प्रत्यक्ष ELISA के चरण[9]April 2025 नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करते हैं:
- परीक्षण किए जाने वाले एंटीजन का एक बफर घोल माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं (आमतौर पर 96-वेल प्लेट) में डाला जाता है, जहाँ इसे आवेश इंटरैक्शन के माध्यम से प्लास्टिक से चिपकने के लिए समय दिया जाता है।
- गैर-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन का एक घोल, जैसे बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन या केसीन, प्रत्येक कुएं में डाला जाता है ताकि कुएं की किसी भी प्लास्टिक सतह को कवर किया जा सके जो एंटीजन द्वारा लेपित नहीं हुई है।
- एक संलग्न (संयुग्मित) एंजाइम के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ी जाती है, जो कुएं को लेपित करने वाले परीक्षण एंटीजन से विशिष्ट रूप से जुड़ती है।
- फिर इस एंजाइम के लिए एक सबस्ट्रेट जोड़ा जाता है। अक्सर, यह सबस्ट्रेट एंजाइम के साथ प्रतिक्रिया पर रंग बदलता है।
- सीरम में मौजूद प्राथमिक एंटीबॉडी की सांद्रता जितनी अधिक होगी, रंग परिवर्तन उतना ही मजबूत होगा। अक्सर, रंग की तीव्रता के लिए मात्रात्मक मान देने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जाता है।
एंजाइम एक एम्पलीफायर के रूप में कार्य करता है; भले ही केवल कुछ एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी बंधे रहें, एंजाइम अणु कई सिग्नल अणु उत्पन्न करेंगे। सामान्य ज्ञान की सीमाओं के भीतर, एंजाइम अनिश्चित काल तक रंग का उत्पादन जारी रख सकता है, लेकिन जितने अधिक एंटीबॉडी बंधे होंगे, रंग उतनी ही तेजी से विकसित होगा। प्रत्यक्ष ELISA का एक बड़ा नुकसान यह है कि एंटीजन स्थिरीकरण की विधि विशिष्ट नहीं है; जब सीरम का उपयोग परीक्षण एंटीजन के स्रोत के रूप में किया जाता है, तो नमूने में मौजूद सभी प्रोटीन माइक्रोटिटर प्लेट के कुएं से चिपक सकते हैं, इसलिए कुएं की सतह से जुड़ते समय सीरम में एनालाइट की कम सांद्रता को अन्य सीरम प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करनी पड़ती है। सैंडविच या अप्रत्यक्ष ELISA इस समस्या का समाधान प्रदान करता है, जिसमें सीरम के आणविक मिश्रण से एंटीजन को बाहर निकालने के लिए परीक्षण एंटीजन के लिए विशिष्ट "कैप्चर" एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।
ELISA को गुणात्मक या मात्रात्मक प्रारूप में चलाया जा सकता है। गुणात्मक परिणाम एक नमूने के लिए एक सरल सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम (हाँ या नहीं) प्रदान करते हैं। सकारात्मक और नकारात्मक के बीच का कटऑफ विश्लेषक द्वारा निर्धारित किया जाता है और यह सांख्यिकीय हो सकता है। सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच अंतर करने के लिए अक्सर मानक विचलन (परीक्षण में निहित त्रुटि) का दो या तीन गुना उपयोग किया जाता है। मात्रात्मक ELISA में, नमूने के ऑप्टिकल घनत्व (OD) की तुलना एक मानक वक्र से की जाती है, जो आमतौर पर लक्ष्य अणु के ज्ञात-सांद्रता वाले घोल का क्रमिक तनुकरण (serial dilution) होता है। उदाहरण के लिए, यदि कोई परीक्षण नमूना 1.0 का OD देता है, तो मानक वक्र पर वह बिंदु जिसने OD = 1.0 दिया, उसी एनालाइट सांद्रता का होना चाहिए जो नमूने में है।
प्रयोग के संदर्भ के आधार पर साहित्य और वेबसाइटों में "अप्रत्यक्ष ELISA" और "प्रत्यक्ष ELISA" नामों का उपयोग और अर्थ भिन्न होता है। जब किसी एंटीजन की उपस्थिति का विश्लेषण किया जाता है, तो "प्रत्यक्ष ELISA" नाम उस ELISA को संदर्भित करता है जिसमें केवल एक लेबल वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, और "अप्रत्यक्ष ELISA" शब्द उस ELISA को संदर्भित करता है जिसमें एंटीजन प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा बंधा होता है जिसे फिर एक लेबल वाले द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। बाद के मामले में, सैंडविच ELISA स्पष्ट रूप से एक अप्रत्यक्ष ELISA से अलग है। जब "प्राथमिक" एंटीबॉडी रुचि का विषय हो, उदाहरण के लिए टीकाकरण विश्लेषण के मामले में, तो इस एंटीबॉडी का पता सीधे द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा लगाया जाता है और "अप्रत्यक्ष ELISA" शब्द दो एंटीबॉडी वाली सेटिंग पर लागू होता है।
सैंडविच
"सैंडविच" ELISA का उपयोग नमूना एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है।[10] चरण इस प्रकार हैं:
- एक सतह को कैप्चर एंटीबॉडी की ज्ञात मात्रा के साथ तैयार किया जाता है।
- सतह पर किसी भी गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध (ब्लॉक) किया जाता है।
- एंटीजन-युक्त नमूना प्लेट पर लगाया जाता है, और एंटीबॉडी द्वारा कैप्चर किया जाता है।
- अनबाउंड एंटीजन को हटाने के लिए प्लेट को धोया जाता है।
- एक विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ा जाता है, और एंटीजन से जुड़ जाता है (इसलिए 'सैंडविच': एंटीजन दो एंटीबॉडी के बीच फंस जाता है)। यह प्राथमिक एंटीबॉडी किसी दाता के सीरम में हो सकता है, जिसका एंटीजन के प्रति प्रतिक्रियाशीलता के लिए परीक्षण किया जाना है।
- एंजाइम-लिंक्ड द्वितीयक एंटीबॉडी को डिटेक्शन एंटीबॉडी के रूप में लगाया जाता है, जो एंटीबॉडी के Fc क्षेत्र (गैर-विशिष्ट) से विशिष्ट रूप से जुड़ते हैं।
- अनबाउंड एंटीबॉडी-एंजाइम संयुग्मों को हटाने के लिए प्लेट को धोया जाता है।
- एक रसायन जोड़ा जाता है जिसे एंजाइम द्वारा रंग, फ्लोरोसेंट, या इलेक्ट्रोकेमिकल सिग्नल में परिवर्तित किया जाता है।
- एंटीजन की उपस्थिति और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्लेट के कुओं के अवशोषण, प्रतिदीप्ति (fluorescence), या इलेक्ट्रोकेमिकल सिग्नल (जैसे, करंट) को मापा जाता है।
दाईं ओर की छवि में एंजाइम से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल है, हालांकि, तकनीकी अर्थ में, यह आवश्यक नहीं है यदि प्राथमिक एंटीबॉडी एंजाइम से संयुग्मित है (जो प्रत्यक्ष ELISA होगा)। हालाँकि, द्वितीयक-एंटीबॉडी संयुग्म का उपयोग हर उस एंटीजन के लिए एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी बनाने की महंगी प्रक्रिया से बचाता है जिसका पता लगाना वांछित हो। अन्य एंटीबॉडी के Fc क्षेत्र से जुड़ने वाले एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी का उपयोग करके, इस समान एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी का उपयोग विभिन्न स्थितियों में किया जा सकता है। "कैप्चर" एंटीबॉडी की पहली परत के बिना, नमूने में मौजूद कोई भी प्रोटीन (सीरम प्रोटीन सहित) प्लेट की सतह पर प्रतिस्पर्धात्मक रूप से सोख (adsorb) सकते हैं, जिससे स्थिर एंटीजन की मात्रा कम हो जाती है। प्लास्टिक से एंटीजन को जोड़ने के लिए शुद्ध विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने से माप से पहले जटिल मिश्रणों से एंटीजन को शुद्ध करने की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जिससे एसे सरल हो जाता है, और एसे की विशिष्टता और संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इसलिए, अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले सैंडविच ELISA को अक्सर गलत सकारात्मक परिणामों के जोखिम को कम करने के लिए सत्यापन की आवश्यकता होती है।[11]
प्रतिस्पर्धी (Competitive)
ELISA का तीसरा उपयोग प्रतिस्पर्धी बाइंडिंग के माध्यम से है। इस ELISA के चरण पहले दो उदाहरणों से थोड़े अलग हैं:
अचिह्नित एंटीबॉडी को उसके एंटीजन (नमूने) की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया जाता है।
- इन बंधे हुए एंटीबॉडी/एंटीजन कॉम्प्लेक्स को फिर एंटीजन-लेपित वेल (well) में डाला जाता है।
- प्लेट को धोया जाता है, जिससे अचिह्नित एंटीबॉडी हट जाते हैं। (नमूने में जितना अधिक एंटीजन होगा, उतने ही अधिक Ag-Ab कॉम्प्लेक्स बनेंगे और इसलिए वेल में एंटीजन से जुड़ने के लिए कम अचिह्नित एंटीबॉडी उपलब्ध होंगे, इसीलिए इसे "प्रतिस्पर्धा" कहा जाता है।)
- प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी (secondary antibody) को जोड़ा जाता है। यह दूसरा एंटीबॉडी एंजाइम से जुड़ा होता है।
- एक सबस्ट्रेट (substrate) मिलाया जाता है, और शेष एंजाइम एक क्रोमोजेनिक या फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न करते हैं।
- सिग्नल के अंतिम संतृप्ति को रोकने के लिए प्रतिक्रिया को रोक दिया जाता है।
कुछ प्रतिस्पर्धी ELISA किट में एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी के बजाय एंजाइम-लिंक्ड एंटीजन शामिल होते हैं। चिह्नित एंटीजन नमूना एंटीजन (अचिह्नित) के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी बाइंडिंग साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा करता है। नमूने में जितना कम एंटीजन होगा, वेल में उतना ही अधिक चिह्नित एंटीजन बना रहेगा और सिग्नल उतना ही मजबूत होगा।
आमतौर पर, एंटीजन को पहले वेल में स्थित नहीं किया जाता है।
HIV एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, माइक्रोटाइटर प्लेट के वेल को HIV एंटीजन के साथ लेपित किया जाता है। दो विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, एक एंजाइम के साथ संयुग्मित (conjugated) होता है और दूसरा सीरम में मौजूद होता है (यदि सीरम एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक है)। एक ही एंटीजन के लिए दोनों एंटीबॉडी के बीच संचयी प्रतिस्पर्धा होती है, जिससे एक मजबूत सिग्नल दिखाई देता है। परीक्षण किए जाने वाले सीरम को इन वेल में डाला जाता है और 37 °C पर इनक्यूबेट किया जाता है, और फिर धोया जाता है। यदि एंटीबॉडी मौजूद हैं, तो एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया होती है। एंजाइम-लेबल वाले विशिष्ट HIV एंटीबॉडी के लिए कोई एंटीजन नहीं बचता है। ये एंटीबॉडी जोड़ने पर मुक्त रहते हैं और धोने के दौरान बह जाते हैं। सबस्ट्रेट मिलाया जाता है, लेकिन उस पर कार्य करने के लिए कोई एंजाइम नहीं होता है, इसलिए सकारात्मक परिणाम में कोई रंग परिवर्तन नहीं दिखता है।
अप्रत्यक्ष (Indirect)
एक चौथा ELISA परीक्षण पारंपरिक वेल का उपयोग नहीं करता है, बल्कि एंटीजन को परीक्षण द्रव में निलंबित रखता है।[12]
- अचिह्नित एंटीबॉडी को उसके एंटीजन (नमूने) की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया जाता है।
- एंटीबॉडी को एंटीजन से जुड़ने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त इनक्यूबेशन अवधि प्रदान की जाती है।
- नमूने को फिर स्कैवेंजर कंटेनर (Scavenger container) के माध्यम से गुजारा जाता है। यह एक टेस्ट ट्यूब या विशेष रूप से डिज़ाइन किया गया फ्लो-थ्रू चैनल हो सकता है। स्कैवेंजर कंटेनर या चैनल की सतह पर "स्कैवेंजर एंटीजन" बंधे होते हैं। ये प्राथमिक एंटीजन के समान या पर्याप्त रूप से मिलते-जुलते हो सकते हैं ताकि मुक्त एंटीबॉडी उनसे जुड़ सकें।
- स्कैवेंजर कंटेनर में पर्याप्त सतह क्षेत्र और पर्याप्त समय होना चाहिए ताकि स्कैवेंजर एंटीजन नमूने में पेश किए गए सभी अतिरिक्त एंटीबॉडी से जुड़ सकें।
- नमूना, जिसमें अब टैग किए गए और बंधे हुए एंटीबॉडी होते हैं, को एक डिटेक्टर के माध्यम से गुजारा जाता है। यह उपकरण एक फ्लो साइटोमीटर (flow cytometer) या अन्य उपकरण हो सकता है जो टैग को प्रकाशित करता है और प्रतिक्रिया को दर्ज करता है।[13]
यह परीक्षण एक ही समय में कई एंटीजन को टैग करने और गिनने की अनुमति देता है। यह बैक्टीरिया के विशिष्ट उपभेदों (strains) को दो (या अधिक) अलग-अलग रंग के टैग द्वारा पहचाने जाने की अनुमति देता है। यदि एक कोशिका पर दोनों टैग मौजूद हैं, तो कोशिका उस विशिष्ट स्ट्रेन की है। यदि केवल एक मौजूद है, तो वह नहीं है।
यह परीक्षण आम तौर पर एक बार में एक किया जाता है और इसे माइक्रोटाइटर प्लेट के साथ नहीं किया जा सकता है। आवश्यक उपकरण आमतौर पर कम जटिल होते हैं और इनका उपयोग फील्ड में किया जा सकता है।
आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमेटिक मार्कर
नीचे दी गई तालिका ELISA परख में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमेटिक मार्करों को सूचीबद्ध करती है, जो परख के पूरा होने पर परिणामों को मापने की अनुमति देते हैं।
- OPD (o-फेनिलिडेनेमाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड) HRP (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) का पता लगाने के लिए एम्बर रंग में बदल जाता है, जिसका उपयोग अक्सर संयुग्मित प्रोटीन (conjugated protein) के रूप में किया जाता है।[14]
- TMB (3,3',5,5'-टेट्रामेथिलबेंज़िडाइन) HRP का पता लगाने पर नीला हो जाता है और सल्फ्यूरिक या फॉस्फोरिक एसिड मिलाने के बाद पीला हो जाता है।
- ABTS (2,2'-एज़िनोबिस [3-एथिलबेंज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड]-डायमोनियम साल्ट) HRP का पता लगाने पर हरा हो जाता है।
- PNPP (p-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट, डिसोडियम साल्ट) अल्कलाइन फॉस्फेटेस (alkaline phosphatase) का पता लगाने पर पीला हो जाता है।
अनुप्रयोग
चूंकि ELISA का प्रदर्शन नमूने में एंटीजन की उपस्थिति या एंटीबॉडी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, यह सीरम एंटीबॉडी सांद्रता (जैसे HIV परीक्षण[15] या वेस्ट नाइल वायरस के साथ) निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इसने खाद्य उद्योग में संभावित खाद्य एलर्जी का पता लगाने में भी अनुप्रयोग पाए हैं, जैसे दूध, मूंगफली, अखरोट, बादाम, और अंडे, और सीलिएक रोग के लिए सीरोलॉजिकल रक्त परीक्षण के रूप में। ELISA का उपयोग टॉक्सिकोलॉजी में दवाओं के कुछ वर्गों के लिए एक त्वरित अनुमानित स्क्रीन के रूप में भी किया जा सकता है।
ELISA अपनी उच्च संवेदनशीलता के कारण HIV के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला पहला स्क्रीनिंग परीक्षण था। एक ELISA में, व्यक्ति के सीरम को 400 गुना पतला किया जाता है और एक प्लेट पर लगाया जाता है जिससे HIV एंटीजन जुड़े होते हैं। यदि सीरम में HIV के एंटीबॉडी मौजूद हैं, तो वे इन HIV एंटीजन से जुड़ सकते हैं। फिर सीरम के अन्य सभी घटकों को हटाने के लिए प्लेट को धोया जाता है। एक विशेष रूप से तैयार "द्वितीयक एंटीबॉडी"—एक एंटीबॉडी जो अन्य एंटीबॉडी से जुड़ता है—को फिर प्लेट पर लगाया जाता है, जिसके बाद एक और धुलाई की जाती है। यह द्वितीयक एंटीबॉडी रासायनिक रूप से पहले से ही एक एंजाइम से जुड़ा होता है।
इस प्रकार, प्लेट में प्लेट से जुड़े द्वितीयक एंटीबॉडी की मात्रा के अनुपात में एंजाइम होगा। एंजाइम के लिए एक सबस्ट्रेट लगाया जाता है, और एंजाइम द्वारा उत्प्रेरण से रंग या प्रतिदीप्ति (fluorescence) में परिवर्तन होता है। ELISA परिणामों को एक संख्या के रूप में रिपोर्ट किया जाता है; इस परीक्षण का सबसे विवादास्पद पहलू सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम के बीच "कट-ऑफ" बिंदु निर्धारित करना है।
एक कट-ऑफ बिंदु की तुलना एक ज्ञात मानक के साथ करके निर्धारित की जा सकती है। यदि कार्यस्थल पर ड्रग स्क्रीनिंग के लिए ELISA परीक्षण का उपयोग किया जाता है, तो उदाहरण के लिए 50 ng/ml की कट-ऑफ सांद्रता स्थापित की जाती है, और एनालाइट की मानक सांद्रता वाला एक नमूना तैयार किया जाएगा। अज्ञात जो ज्ञात नमूने की तुलना में मजबूत सिग्नल उत्पन्न करते हैं, वे "सकारात्मक" हैं। जो कमजोर सिग्नल उत्पन्न करते हैं, वे "नकारात्मक" हैं।
विभिन्न प्रकार की बीमारियों, जैसे डेंगू, मलेरिया, चागास रोग,[16] जोन्स रोग, और अन्य का पता लगाने के लिए ELISA परीक्षण हैं। ELISA परीक्षणों का उपयोग चिकित्सा प्रयोगशालाओं में इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स के लिए भी व्यापक रूप से किया जाता है। ELISA के अन्य उपयोगों में शामिल हैं:
- रक्त के नमूनों में SARS-CoV-2 एंटीबॉडी का पता लगाना[17]
ELISA 2023 तक दुनिया भर में पादप रोगजनक (plant pathogen) का पता लगाने की प्राथमिक विधि है।[18]
एंजाइम-लिंक्ड सिंगल मॉलिक्यूल ऐरे (eSimoa)
eSimoa (एंजाइम-लिंक्ड सिंगल मॉलिक्यूल ऐरे) पारंपरिक ELISA (एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट ऐसे) तकनीक का एक महत्वपूर्ण विकास है, जिसका व्यापक रूप से नैदानिक निदान और अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। बायोमोलेक्यूलर डिटेक्शन की संवेदनशीलता और रिज़ॉल्यूशन को काफी बढ़ाकर, eSimoa ELISA की क्षमताओं का विस्तार करता है, जिससे उन सांद्रता पर बायोमोलेक्यूल्स का पता लगाना संभव हो जाता है जो मानक परीक्षणों के साथ पहले अप्राप्य थे।[19]
प्रौद्योगिकी
ELISA के मूलभूत सिद्धांतों पर निर्माण करते हुए, eSimoa ELISA के प्लेट-आधारित डिटेक्शन के समान तरीके से बायोमोलेक्यूल्स या एंजाइमों को अलग करने के लिए पैरामैग्नेटिक बीड्स का उपयोग करता है। हालाँकि, eSimoa इस अवधारणा को सिंगल-मॉलिक्यूल स्तर पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया माप को सक्षम करके आगे बढ़ाता है, जो विभिन्न एंजाइमों और बायोमोलेक्यूल्स के लिए डिटेक्शन सीमा में नाटकीय रूप से सुधार करता है। यह विधि कम प्रचुरता वाले प्रोटीन और प्रोटीन काइनेज और टेलोमेरेज़ जैसे महत्वपूर्ण एंजाइमों की गतिविधि के सटीक परिमाणीकरण की अनुमति देती है, जो अक्सर पारंपरिक ELISA की डिटेक्शन सीमा से नीचे होते हैं।
अनुप्रयोग
eSimoa की बढ़ी हुई संवेदनशीलता नैदानिक निदान में प्रारंभिक और सटीक बायोमार्कर डिटेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, जो बेहतर रोग निगरानी और प्रबंधन की सुविधा प्रदान करती है। दवा की खोज में, एंजाइमेटिक गतिविधि में सूक्ष्म परिवर्तनों को ट्रैक करने की क्षमता एंजाइम निषेध तंत्र में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करके अधिक प्रभावी फार्मास्यूटिकल्स के विकास में सहायता करती है।
उत्पत्ति और विवाद
eSimoa पर मूल कार्य हार्वर्ड यूनिवर्सिटी में डेविड आर. वॉल्ट की टीम द्वारा किया गया था, जिन्होंने 2020 में अपना काम प्रकाशित किया था[19]। हालाँकि, इस तकनीक के विकास का दावा नेशनल ताइवान यूनिवर्सिटी (NTU) की ची-एन चेंग द्वारा 2023 और 2024 में विवादित है, जिन्होंने दावा किया है कि उनकी टीम ने इस तकनीक को विकसित किया था।
नोट्स और संदर्भ
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स्रोत: अंग्रेज़ी विकिपीडिया के “ELISA” लेख का अनुवाद। मूल लेख: https://en.wikipedia.org/wiki/ELISA यह अनुवाद स्वचालित रूप से तैयार किया गया है।
