प्राइमर (आणविक जीवविज्ञान)
एक प्राइमर (primer) एक छोटा, एकल-स्ट्रैंड वाला न्यूक्लिक एसिड है जिसका उपयोग सभी जीवित जीव DNA संश्लेषण की शुरुआत में करते हैं। एक सिंथेटिक प्राइमर एक प्रकार का ओलिगो होता है, जो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का संक्षिप्त रूप है। DNA पॉलीमरेज़ (जो DNA प्रतिकृति के लिए जिम्मेदार होते हैं) केवल एक मौजूदा न्यूक्लिक एसिड के 3'-सिरे पर न्यूक्लियोटाइड जोड़ने में सक्षम होते हैं, जिसके लिए आवश्यक है कि DNA पॉलीमरेज़ द्वारा एक पूरक स्ट्रैंड शुरू करने से पहले एक प्राइमर टेम्पलेट से बंधा हो।[1]
DNA पॉलीमरेज़ RNA प्राइमर से जुड़ने के बाद न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है और पूरे स्ट्रैंड का संश्लेषण करता है। बाद में, RNA स्ट्रैंड्स को सटीक रूप से हटाकर DNA न्यूक्लियोटाइड से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। यह एक गैप क्षेत्र बनाता है जिसे निक (nick) कहा जाता है, जिसे लिगेज़ का उपयोग करके भरा जाता है।[2] RNA प्राइमर को हटाने की प्रक्रिया में Fen1, Lig1 जैसे कई एंजाइमों की आवश्यकता होती है, जो DNA पॉलीमरेज़ के साथ समन्वय में काम करते हैं, ताकि RNA न्यूक्लियोटाइड को हटाने और DNA न्यूक्लियोटाइड को जोड़ने की प्रक्रिया सुनिश्चित की जा सके।
जीवित जीव केवल RNA प्राइमरों का उपयोग करते हैं, जबकि जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान की प्रयोगशाला तकनीकों में जिन्हें इन विट्रो DNA संश्लेषण की आवश्यकता होती है (जैसे DNA अनुक्रमण और पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन), आमतौर पर DNA प्राइमरों का उपयोग किया जाता है, क्योंकि वे अधिक तापमान स्थिर होते हैं। प्राइमरों को प्रयोगशाला में विशिष्ट प्रतिक्रियाओं जैसे पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। PCR प्राइमरों को डिज़ाइन करते समय, कुछ विशिष्ट उपायों पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे प्राइमरों का गलनांक (melting temperature) और स्वयं प्रतिक्रिया का एनीलिंग तापमान।
RNA प्राइमर इन विवो
আরও দেখুন: DNA polymerase, DNA replicationRNA प्राइमरों का उपयोग जीवित जीवों द्वारा DNA के एक स्ट्रैंड को संश्लेषित करने की शुरुआत में किया जाता है। प्राइमेज़ (primase) नामक एंजाइमों का एक वर्ग लीडिंग और लैगिंग स्ट्रैंड दोनों पर डी नोवो (de novo) पढ़ने वाले टेम्पलेट में एक पूरक RNA प्राइमर जोड़ता है। प्राइमर के मुक्त 3'-OH से शुरू होकर, जिसे प्राइमर टर्मिनस के रूप में जाना जाता है, एक DNA पॉलीमरेज़ एक नए संश्लेषित स्ट्रैंड का विस्तार कर सकता है। DNA प्रतिकृति में लीडिंग स्ट्रैंड को प्रतिकृति कांटे के साथ चलते हुए एक निरंतर टुकड़े में संश्लेषित किया जाता है, जिसके लिए संश्लेषण शुरू करने के लिए केवल एक प्रारंभिक RNA प्राइमर की आवश्यकता होती है। लैगिंग स्ट्रैंड में, टेम्पलेट DNA 5′→3′ दिशा में चलता है। चूंकि DNA पॉलीमरेज़ टेम्पलेट स्ट्रैंड के पूरक 3′→5′ दिशा में आधार नहीं जोड़ सकता है, इसलिए DNA को प्रतिकृति कांटे से दूर जाते हुए छोटे टुकड़ों में 'पीछे की ओर' संश्लेषित किया जाता है, जिन्हें ओकाज़ाकी टुकड़े (Okazaki fragments) के रूप में जाना जाता है। लीडिंग स्ट्रैंड के विपरीत, यह विधि DNA संश्लेषण के बार-बार शुरू होने और रुकने का परिणाम देती है, जिसके लिए कई RNA प्राइमरों की आवश्यकता होती है। DNA टेम्पलेट के साथ, प्राइमेज़ RNA प्राइमरों को बिखेरता है जिनका उपयोग DNA पॉलीमरेज़ 5′→3′ दिशा में DNA को संश्लेषित करने के लिए करता है।[1]
DNA संश्लेषण को सक्षम करने के लिए प्राइमरों का उपयोग किए जाने का एक और उदाहरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ एक एंजाइम है जो DNA का एक पूरक स्ट्रैंड संश्लेषित करने के लिए RNA के एक टेम्पलेट स्ट्रैंड का उपयोग करता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ के DNA पॉलीमरेज़ घटक को संश्लेषण शुरू करने के लिए एक मौजूदा 3' सिरे की आवश्यकता होती है।[1]
प्राइमर हटाना
ओकाज़ाकी टुकड़ों के सम्मिलन के बाद, RNA प्राइमरों को हटा दिया जाता है (हटाने की क्रियाविधि प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स के बीच भिन्न होती है) और नए डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स से बदल दिया जाता है जो उन अंतरालों को भरते हैं जहाँ RNA प्राइमर मौजूद था। DNA लिगेज़ फिर खंडित स्ट्रैंड्स को एक साथ जोड़ता है, जिससे लैगिंग स्ट्रैंड का संश्लेषण पूरा हो जाता है।[1]
प्रोकैरियोट्स में, DNA पॉलीमरेज़ I ओकाज़ाकी टुकड़े को तब तक संश्लेषित करता है जब तक कि वह पिछले RNA प्राइमर तक नहीं पहुँच जाता। फिर एंजाइम एक साथ 5′→3′ एक्सोन्यूक्लिएज़ के रूप में कार्य करता है, जो सामने मौजूद प्राइमर राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को हटाता है और पीछे डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स जोड़ता है। पॉलीमराइज़ेशन और RNA प्राइमर के निष्कासन की दोनों गतिविधियाँ 5′→3′ दिशा में होती हैं, और पॉलीमरेज़ I इन गतिविधियों को एक साथ कर सकता है; इसे "निक ट्रांसलेशन" (Nick Translation) के रूप में जाना जाता है।[1] निक ट्रांसलेशन RNA प्राइमर को हटाने और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स को जोड़ने में पॉलीमरेज़ I की समन्वित गतिविधि को संदर्भित करता है। बाद में, स्ट्रैंड्स के बीच एक अंतराल बनता है जिसे निक कहा जाता है, जिसे DNA लिगेज़ का उपयोग करके सील कर दिया जाता है।
यूकेरियोट्स में लैगिंग स्ट्रैंड में RNA प्राइमरों को हटाना प्रतिकृति को पूरा करने के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, जैसे-जैसे लैगिंग स्ट्रैंड DNA पॉलीमरेज़ δ द्वारा 5′→3′ दिशा में संश्लेषित होता है, ओकाज़ाकी टुकड़े बनते हैं, जो DNA के असंतत स्ट्रैंड होते हैं। फिर, जब DNA पॉलीमरेज़ पिछले ओकाज़ाकी टुकड़े से RNA प्राइमर के 5' सिरे तक पहुँचता है, तो यह प्राइमर के 5' सिरे को एक एकल-स्ट्रैंड वाले RNA फ्लैप में विस्थापित कर देता है जिसे न्यूक्लिएज़ क्लीवेज द्वारा हटा दिया जाता है। RNA फ्लैप्स के क्लीवेज में प्राइमर हटाने की तीन विधियाँ शामिल हैं।[3] प्राइमर हटाने की पहली संभावना एक छोटा फ्लैप बनाकर है जिसे सीधे फ्लैप स्ट्रक्चर-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिएज़ 1 (FEN-1) द्वारा हटा दिया जाता है, जो 5' ओवरहैंगिंग फ्लैप को काटता है। इस विधि को RNA प्राइमर हटाने का शॉर्ट फ्लैप पाथवे कहा जाता है। RNA प्राइमर को काटने का दूसरा तरीका RNase का उपयोग करके RNA स्ट्रैंड को नीचा दिखाना (degrade) है, यूकेरियोट्स में इसे RNase H2 के रूप में जाना जाता है। यह एंजाइम प्राइमर के 5' सिरे के करीब के न्यूक्लियोटाइड्स को छोड़कर, अधिकांश एनील्ड RNA प्राइमर को नीचा दिखाता है। इस प्रकार, शेष न्यूक्लियोटाइड्स एक फ्लैप में प्रदर्शित होते हैं जिसे FEN-1 का उपयोग करके काट दिया जाता है। RNA प्राइमर को हटाने की अंतिम संभावित विधि को लॉन्ग फ्लैप पाथवे के रूप में जाना जाता है। इस मार्ग में RNA प्राइमर को लंबा करने और फिर उसे काटने के लिए कई एंजाइमों की भर्ती की जाती है। फ्लैप्स को 5' से 3' हेलिकेज़ द्वारा लंबा किया जाता है, जिसे Pif1 के रूप में जाना जाता है। Pif1 द्वारा फ्लैप में न्यूक्लियोटाइड्स जोड़ने के बाद, लंबे फ्लैप को प्रतिकृति प्रोटीन A (RPA) द्वारा स्थिर किया जाता है। RPA-बाउंड DNA FEN1 की गतिविधि या भर्ती को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्लैप को काटने के लिए एक और न्यूक्लिएज़ की भर्ती की जानी चाहिए। यह दूसरा न्यूक्लिएज़ DNA2 न्यूक्लिएज़ है, जिसमें हेलिकेज़-न्यूक्लिएज़ गतिविधि होती है, जो RNA प्राइमर के लंबे फ्लैप को काटती है, जो फिर कुछ न्यूक्लियोटाइड्स को पीछे छोड़ देती है जिन्हें FEN1 द्वारा काट दिया जाता है। अंत में, जब सभी RNA प्राइमरों को हटा दिया जाता है, तो ओकाज़ाकी टुकड़ों के बीच निक्स बनते हैं जिन्हें लिगेज़ 1 नामक एंजाइम का उपयोग करके डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ भर दिया जाता है, जिसे लिगेशन नामक प्रक्रिया के माध्यम से किया जाता है।
सिंथेटिक प्राइमरों के उपयोग
न्यूक्लिक एसिड विधियाँ
सिंथेटिक प्राइमर रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स होते हैं, आमतौर पर DNA के, जिन्हें टेम्पलेट DNA पर एक विशिष्ट साइट पर एनील करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। समाधान में, प्राइमर DNA पॉलीमरेज़ द्वारा विस्तारित होने से पहले वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग के माध्यम से टेम्पलेट के साथ सहज रूप से हाइब्रिडाइज हो जाता है। सेंगर अनुक्रमण और नेक्स्ट-जेनरेशन सीक्वेंसिंग दोनों को प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए प्राइमरों की आवश्यकता होती है।[1]
PCR प्राइमर डिज़ाइन
पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) प्रवर्धित किए जा रहे अनुक्रम के विपरीत सिरों पर एक-दूसरे की ओर DNA बढ़ाव को निर्देशित करने के लिए कस्टम प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग करता है। ये प्राइमर आमतौर पर लंबाई में 18 और 24 बेस के बीच होते हैं और प्रवर्धित किए जा रहे अनुक्रम की विशिष्ट अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम साइटों के पूरक होते हैं।[1]
प्राइमर के जोड़ों को समान मेल्टिंग तापमान (गलनांक) रखने के लिए डिज़ाइन किया जाता है क्योंकि PCR के दौरान दोनों स्ट्रैंड्स (रज्जुओं) के लिए एनीलिंग एक साथ होती है। मेल्टिंग तापमान प्रतिक्रिया के एनीलिंग तापमान से बहुत अधिक या बहुत कम नहीं होना चाहिए। यदि एनीलिंग तापमान बहुत कम होता है, तो गैर-विशिष्ट संरचनाएं बन सकती हैं, जिससे प्रतिक्रिया की दक्षता कम हो जाती है।[4]
इसके अतिरिक्त, प्राइमर अनुक्रमों को DNA के एक क्षेत्र के लिए विशिष्ट रूप से चुनने की आवश्यकता होती है, ताकि पास के किसी समान अनुक्रम के साथ संकरण (हाइब्रिडाइजेशन) की संभावना से बचा जा सके। प्राइमर साइट चुनने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि BLAST सर्च है, जिसके द्वारा उन सभी संभावित क्षेत्रों को देखा जा सकता है जिनसे प्राइमर जुड़ सकता है। न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम और प्राइमर दोनों को ही BLAST सर्च किया जा सकता है। मुफ्त NCBI टूल Primer-BLAST प्राइमर डिज़ाइन और BLAST सर्च को एक ही एप्लिकेशन में एकीकृत करता है,[5] जैसा कि ePrime और Beacon Designer जैसे व्यावसायिक सॉफ्टवेयर उत्पाद करते हैं। डिज़ाइन किए गए प्राइमरों की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए इन सिलिको PCR किया जा सकता है।
प्राइमर बाइंडिंग के लिए DNA के एक विशिष्ट क्षेत्र का चयन करने के लिए कुछ अतिरिक्त विचारों की आवश्यकता होती है। मोनो-न्यूक्लियोटाइड और डाई-न्यूक्लियोटाइड दोहराव वाले क्षेत्रों से बचना चाहिए, क्योंकि लूप का निर्माण हो सकता है और यह गलत संकरण (मिसहाइब्रिडाइजेशन) में योगदान दे सकता है। जो प्राइमर एक-दूसरे के पूरक होते हैं, वे प्राइमर-डाइमर के निर्माण का कारण बन सकते हैं, जिससे वांछित प्रतिक्रिया की दक्षता कम हो जाती है।[6] जो प्राइमर स्वयं के साथ एनील करने में सक्षम होते हैं, वे आंतरिक हेयरपिन और लूप बना सकते हैं जो टेम्पलेट DNA के साथ संकरण में बाधा डालते हैं।
प्राइमर डिज़ाइन करते समय, प्रत्येक प्राइमर के पिछले सिरों पर अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड बेस जोड़े जा सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धित (एम्प्लीफाइड) क्षेत्र के प्रत्येक सिरे पर एक अनुकूलित कैप अनुक्रम प्राप्त होता है। इस अभ्यास का एक अनुप्रयोग TA cloning में उपयोग के लिए है, जो PCR के समान एक विशेष सब-क्लोनिंग तकनीक है, जहाँ 5′ और 3′ सिरों पर AG पूंछ जोड़कर दक्षता बढ़ाई जा सकती है।[7]
डिजेनरेट प्राइमर
মূল নিবন্ধ: Degenerate bases कुछ स्थितियों में डिजेनरेट प्राइमरों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। ये प्राइमरों के मिश्रण होते हैं जो समान होते हैं, लेकिन बिल्कुल एक जैसे नहीं होते। जब विभिन्न जीवों से एक ही जीन को प्रवर्धित (एम्प्लीफाई) करना हो, तो ये सुविधाजनक हो सकते हैं, क्योंकि अनुक्रम संभवतः समान होते हैं लेकिन बिल्कुल एक जैसे नहीं होते। यह तकनीक उपयोगी है क्योंकि आनुवंशिक कोड स्वयं डिजेनरेट होता है, जिसका अर्थ है कि कई अलग-अलग कोडोन एक ही अमीनो एसिड के लिए कोड कर सकते हैं। यह विभिन्न जीवों को काफी अलग आनुवंशिक अनुक्रम रखने की अनुमति देता है जो अत्यधिक समान प्रोटीन के लिए कोड करते हैं। इस कारण से, डिजेनरेट प्राइमरों का उपयोग तब भी किया जाता है जब प्राइमर डिज़ाइन प्रोटीन अनुक्रम पर आधारित होता है, क्योंकि कोडोन का विशिष्ट अनुक्रम ज्ञात नहीं होता है। इसलिए, अमीनो एसिड आइसोल्यूसीन के अनुरूप प्राइमर अनुक्रम "ATH" हो सकता है, जहाँ A का अर्थ एडेनिन, T का अर्थ थाइमिन, और H का अर्थ एडेनिन, थाइमिन, या साइटोसिन है, जो प्रत्येक कोडोन के लिए आनुवंशिक कोड के अनुसार है, जिसमें डिजेनरेट बेस के लिए IUPAC प्रतीकों का उपयोग किया गया है। डिजेनरेट प्राइमर लक्ष्य अनुक्रम के साथ पूरी तरह से संकरित नहीं हो सकते हैं, जो PCR प्रवर्धन की विशिष्टता को काफी कम कर सकता है।
डिजेनरेट प्राइमर व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं और सूक्ष्मजीव पारिस्थितिकी के क्षेत्र में अत्यंत उपयोगी हैं। वे अब तक असंवर्धित सूक्ष्मजीवों से जीन के प्रवर्धन की अनुमति देते हैं या उन जीवों से जीन की रिकवरी की अनुमति देते हैं जहाँ जीनोमिक जानकारी उपलब्ध नहीं है। आमतौर पर, डिजेनरेट प्राइमर GenBank में पाए जाने वाले जीन अनुक्रमण को संरेखित (अलाइन) करके डिज़ाइन किए जाते हैं। व्यक्तिगत बेस के लिए IUPAC डिजेनरेसी का उपयोग करके अनुक्रमों के बीच के अंतर को ध्यान में रखा जाता है। इसके बाद PCR प्राइमरों को कोडोन अनुक्रम के सभी क्रमपरिवर्तनों (परम्यूटेशन) के अनुरूप प्राइमरों के मिश्रण के रूप में संश्लेषित किया जाता है।
संदर्भ
- ↑ 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 (December 21, 2016). "Molecular Biology: Principles and practice". W. H. Freeman. ISBN 978-1-319-11637-8.
- ↑ Henneke, Ghislaine. (2012-09-26). "In vitro reconstitution of RNA primer removal in Archaea reveals the existence of two pathways". Biochemical Journal. 447 (2) 271–280. doi:10.1042/BJ20120959.
- ↑ (2015-10-01). "Primer removal during mammalian mitochondrial DNA replication". DNA Repair. 34 28–38. doi:10.1016/j.dnarep.2015.07.003.
- ↑ (March 2016). "Versatility of different melting temperature (Tm) calculator software for robust PCR and real-time PCR oligonucleotide design: A practical guide". Gene Reports. 2 1–3. doi:10.1016/j.genrep.2015.11.001.
- ↑ Primer-BLAST. NCBI.
- ↑ (2008). Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. 63–90. Springer Netherlands. ISBN 978-1-4020-6241-4. doi:10.1007/978-1-4020-6241-4_5.
- ↑ (April 2007). "Adenosine added on the primer 5′ end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products". Analytical Biochemistry. 363 (1) 163–165. doi:10.1016/j.ab.2007.01.014.
स्रोत: अंग्रेज़ी विकिपीडिया के “Primer (molecular biology)” लेख का अनुवाद। मूल लेख: https://en.wikipedia.org/wiki/Primer_(molecular_biology) यह अनुवाद स्वचालित रूप से तैयार किया गया है।
