वैकल्पिक स्प्लाइसिंग

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वैकल्पिक स्प्लाइसिंग (Alternative splicing), वैकल्पिक आरएनए स्प्लाइसिंग (alternative RNA splicing), या विभेदी स्प्लाइसिंग (differential splicing) जीन अभिव्यक्ति के दौरान होने वाली एक वैकल्पिक स्प्लाइसिंग प्रक्रिया है जो एक ही जीन को विभिन्न स्प्लाइस वेरिएंट उत्पन्न करने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, किसी जीन के कुछ एक्सॉन उस जीन के अंतिम RNA उत्पाद में शामिल किए जा सकते हैं या उससे बाहर रखे जा सकते हैं।[1] इसका मतलब यह है कि एक्सॉन अलग-अलग संयोजनों में जुड़ते हैं, जिससे अलग-अलग स्प्लाइस वेरिएंट बनते हैं। प्रोटीन-कोड करने वाले जीनों के मामले में, इन स्प्लाइस वेरिएंट से अनुवादित प्रोटीन उनके अमीनो अम्ल अनुक्रम (सीक्वेंस) और उनके जैविक कार्यों में अंतर रख सकते हैं (चित्र देखें)।

जैविक रूप से प्रासंगिक वैकल्पिक स्प्लाइसिंग यूकैरियोट्स में एक सामान्य घटना के रूप में होती है, जहाँ यह जीनोम द्वारा एनकोड किए जा सकने वाले प्रोटीनों की संख्या को बढ़ाती है।[1] मनुष्यों में, ऐसा व्यापक रूप से माना जाता है कि लगभग 95% बहु-एक्सॉन (multi-exonic) जीन एक ही जीन से कार्यात्मक वैकल्पिक उत्पाद उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस किए जाते हैं[2] लेकिन कई वैज्ञानिकों का मानना है कि देखे गए अधिकांश स्प्लाइस वेरिएंट स्प्लाइसिंग त्रुटियों के कारण होते हैं और जैविक रूप से प्रासंगिक वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस किए गए जीनों की वास्तविक संख्या बहुत कम है।[3][4]

खोज

वैकल्पिक स्प्लाइसिंग को पहली बार 1977 में देखा गया था।[5][6] एडेनोवाइरस अपने संक्रामक चक्र की शुरुआत में, वायरल DNA प्रतिकृति से पहले, पांच प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट उत्पन्न करता है, और डीएनए प्रतिकृति शुरू होने के बाद बाद में एक अतिरिक्त ट्रांसक्रिप्ट उत्पन्न करता है। डीएनए प्रतिकृति शुरू होने के बाद भी शुरुआती प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट उत्पन्न होते रहते हैं। संक्रमण के बाद में उत्पन्न होने वाला अतिरिक्त प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट बड़ा होता है और 32kb एडेनोवाइरस जीनोम के 5/6 भाग से आता है। यह संक्रमित कोशिकाओं में मौजूद किसी भी व्यक्तिगत एडेनोवाइरस mRNA की तुलना में बहुत बड़ा है। शोधकर्ताओं ने पाया कि एडेनोवाइरस टाइप 2 द्वारा देर के चरण में उत्पादित प्राथमिक आरएनए ट्रांसक्रिप्ट को कई अलग-अलग तरीकों से स्प्लाइस किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न वायरल प्रोटीनों को एनकोड करने वाले mRNA बने। इसके अलावा, प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट में कई पॉलियाडेनिलेशन साइटें थीं, जिससे संसाधित (processed) mRNA के लिए अलग-अलग 3' सिरे प्राप्त हुए।[7][8][9]

1981 में, एक सामान्य, अंतर्जात जीन से एक ट्रांसक्रिप्ट में वैकल्पिक स्प्लाइसिंग का पहला उदाहरण विशेषता सहित वर्णित किया गया था।[7] थायरॉइड हॉर्मोन कैल्सीटोनिन को एनकोड करने वाला जीन स्तनधारी कोशिकाओं में वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस किया हुआ पाया गया। इस जीन के प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट में 6 एक्सॉन होते हैं; कैल्सीटोनिन mRNA में एक्सॉन 1–4 होते हैं, और एक्सॉन 4 में एक पॉलियाडेनिलेशन साइट के बाद समाप्त होता है। एक्सॉन 4 को छोड़कर इस प्री-mRNA से एक और mRNA उत्पन्न होता है, और इसमें एक्सॉन 1–3, 5 और 6 शामिल होते हैं। यह CGRP (कैल्सीटोनिन जीन संबंधित पेप्टाइड) के रूप में जाने जाने वाले प्रोटीन को एनकोड करता है।[10][11] स्तनधारियों में इम्युनोग्लोबुलिन जीन ट्रांसक्रिप्ट्स में वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के उदाहरण भी 1980 के दशक की शुरुआत में देखे गए थे।[7][12]

तब से, यूकेरियोट्स में जैविक रूप से प्रासंगिक वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के कई अन्य उदाहरण पाए गए हैं।[1] वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के लिए "रिकॉर्ड-धारक" D. melanogaster का एक जीन है जिसे Dscam कहा जाता है, जिसमें संभावित रूप से 38,016 स्प्लाइस वेरिएंट हो सकते हैं।[13]

2021 में, यह पता चला कि एडेनोवाइरस टाइप 2 का जीनोम, वह एडेनोवाइरस जिसमें वैकल्पिक स्प्लाइसिंग पहली बार पहचानी गई थी, पहले की तुलना में बहुत अधिक विविधता वाले स्प्लाइस वेरिएंट उत्पन्न करने में सक्षम था।[14] अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (next generation sequencing) तकनीक का उपयोग करके, शोधकर्ता मानव एडेनोवाइरस टाइप 2 ट्रांसक्रिप्टोम को अपडेट करने में सक्षम हुए और वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के एक जटिल पैटर्न के माध्यम से वायरस द्वारा उत्पादित 904 स्प्लाइस वेरिएंट की उपस्थिति का दस्तावेजीकरण किया। इनमें से बहुत कम स्प्लाइस वेरिएंट कार्यात्मक साबित हुए हैं, एक ऐसा बिंदु जिसे लेखकों ने अपने शोध पत्र में उठाया है।

"एक उत्कृष्ट प्रश्न यह है कि नए आरएनए के इस समूह की क्या भूमिकाएं हैं या क्या वे एक अतिभारित स्प्लाइसिंग तंत्र द्वारा उत्पन्न नकली अणु हैं।"[14]

मोड (प्रकार)

[15]वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के पांच मूल मोड आमतौर पर पहचाने जाते हैं।[1][2][16][15]

  • एक्सॉन स्किपिंग (Exon skipping) या कैसैट एक्सॉन (cassette exon): इस स्थिति में, एक एक्सॉन को प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट से स्प्लाइस करके हटाया जा सकता है या बनाए रखा जा सकता है। यह स्तनधारी pre-mRNA में सबसे आम मोड है।[15]
  • पारस्परिकता से अनन्य एक्सॉन (Mutually exclusive exons): स्प्लाइसिंग के बाद mRNA में दो एक्सॉन में से एक को बनाए रखा जाता है, लेकिन दोनों को नहीं।
  • वैकल्पिक दाता साइट (Alternative donor site): एक वैकल्पिक 5' स्प्लाइस जंक्शन (दाता साइट) का उपयोग किया जाता है, जो अपस्ट्रीम एक्सॉन की 3' सीमा को बदल देता है।
  • वैकल्पिक स्वीकर्ता साइट (Alternative acceptor site): एक वैकल्पिक 3' स्प्लाइस जंक्शन (स्वीकर्ता साइट) का उपयोग किया जाता है, जो डाउनस्ट्रीम एक्सॉन की 5' सीमा को बदल देता है।
  • इंट्रॉन प्रतिधारण (Intron retention): एक अनुक्रम (sequence) को एक इंट्रॉन के रूप में स्प्लाइस करके बाहर निकाला जा सकता है या सीधे बनाए रखा जा सकता है। इसे एक्सॉन स्किपिंग से अलग माना जाता है क्योंकि बनाए रखे गए अनुक्रम के दोनों और इंट्रॉन नहीं होते हैं। यदि बनाए रखा गया इंट्रॉन कोडिंग क्षेत्र में है, तो इंट्रॉन को पड़ोसी एक्सॉन के साथ फ्रेम में अमीनो एसिड को एनकोड करना चाहिए, अन्यथा एक स्टॉप कोडॉन या रीडिंग फ्रेम में बदलाव के कारण प्रोटीन गैर-कार्यात्मक हो जाएगा। यह स्तनधारियों में सबसे दुर्लभ मोड है लेकिन पौधों में सबसे आम है।[15][17]

वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के इन प्राथमिक मोड के अलावा, दो अन्य मुख्य तंत्र हैं जिनके द्वारा एक ही जीन से अलग-अलग mRNA उत्पन्न किए जा सकते हैं; एकाधिक प्रमोटर और एकाधिक पॉलियाडेनिलेशन साइटें। एकाधिक प्रमोटरों के उपयोग को वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के बजाय एक अनुलेखीय विनियमन (transcriptional regulation) तंत्र के रूप में ठीक से वर्णित किया जाता है; विभिन्न बिंदुओं पर ट्रांसक्रिप्शन शुरू करके, सबसे अधिक 5'-सिरे वाले एक्सॉन वाले ट्रांसक्रिप्ट उत्पन्न किए जा सकते हैं। दूसरे छोर पर, एकाधिक पॉलियाडेनिलेशन साइटें ट्रांसक्रिप्ट के लिए अलग-अलग 3' अंतिम बिंदु प्रदान करती हैं। इन दोनों तंत्रों को वैकल्पिक स्प्लाइसिंग के साथ संयोजन में पाया जाता है और ये एक जीन से प्राप्त mRNA में अतिरिक्त विविधता प्रदान करते हैं।[1][16]


ये मोड बुनियादी स्प्लाइसिंग तंत्रों का वर्णन करते हैं, लेकिन जटिल स्प्लाइसिंग घटनाओं का वर्णन करने के लिए अपर्याप्त हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, दाईं ओर का चित्र माउस ह्यालुरोनिडेस 3 जीन से तीन स्प्लाइसफ़ॉर्म दिखाता है। पहली पंक्ति (हरा) में दिखाई गई एक्सॉन संरचना की तुलना दूसरी पंक्ति (पीला) में दिखाई गई संरचना से करने पर इंट्रॉन प्रतिधारण (retention) दिखाई देता है, जबकि दूसरे और तीसरे स्प्लाइसफ़ॉर्म (पीला बनाम नीला) के बीच की तुलना एक्सॉन स्किपिंग को प्रदर्शित करती है। सभी संभावित स्प्लाइसिंग पैटर्न को विशिष्ट रूप से नामित करने के लिए हाल ही में एक मॉडल नामकरण प्रस्तावित किया गया है।[15]

तंत्र (Mechanisms)

सामान्य स्प्लाइसिंग तंत्र

মূল নিবন্ধ: RNA splicing [16] जब डीएनए से प्री-mRNA को ट्रांसक्राइब किया जाता है, तो इसमें कई इंट्रॉन और एक्सॉन शामिल होते हैं। (नार्वेजियन कृमिकों या नेमाटोड में, माध्य 4-5 एक्सॉन और इंट्रॉन होता है; फल मक्खी ड्रोसोफिला में एक ट्रांसक्राइब किए गए प्री-mRNA में 100 से अधिक इंट्रॉन और एक्सॉन हो सकते हैं।) mRNA में बनाए रखे जाने वाले एक्सॉन स्प्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान निर्धारित होते हैं। स्प्लाइस साइटों का विनियमन और चयन ट्रांस-एक्टिंग स्प्लाइसिंग एक्टिवेटर और स्प्लाइसिंग रिप्रेसर प्रोटीन के साथ-साथ प्री-mRNA के भीतर ही मौजूद सिस-एक्टिंग तत्वों जैसे एक्सोनिक स्प्लाइसिंग एन्हांसर्स और एक्सोनिक स्प्लाइसिंग साइलेंसर्स द्वारा किया जाता है।

विशिष्ट यूकेरियोटिक परमाणु इंट्रॉन में महत्वपूर्ण क्षेत्रों को परिभाषित करने वाले कंसेंसस सीक्वेंस (सर्वसम्मति अनुक्रम) होते हैं। प्रत्येक इंट्रॉन के 5' सिरे पर GU अनुक्रम होता है। 3' सिरे के पास एक शाखा साइट (branch site) होती है। शाखा बिंदु पर न्यूक्लियोटाइड हमेशा A होता है; इस अनुक्रम के आसपास की सर्वसम्मति कुछ हद तक भिन्न होती है। मनुष्यों में शाखा साइट सर्वसम्मति अनुक्रम yUnAy है।[18] शाखा साइट के बाद पाइरीमिडाइन की एक श्रृंखला होती है - पॉलिपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट - उसके बाद 3' सिरे पर AG होता है।[16]

mRNA की स्प्लाइसिंग एक आरएनए और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स द्वारा की जाती है जिसे स्प्लाइसोसोम कहा जाता है, जिसमें U1, U2, U4, U5 और U6 नामित snRNPs होते हैं (U3 mRNA स्प्लाइसिंग में शामिल नहीं है)।[19] U1, 5' GU से जुड़ता है और U2, U2AF प्रोटीन कारकों की सहायता से, शाखा साइट के भीतर शाखा बिंदु A से जुड़ता है। इस चरण में कॉम्प्लेक्स को स्प्लाइसोसोम A कॉम्प्लेक्स के रूप में जाना जाता है। A कॉम्प्लेक्स का निर्माण आमतौर पर स्प्लाइस किए जाने वाले इंट्रॉन के सिरों को निर्धारित करने और बनाए रखे जाने वाले एक्सॉन के सिरों को परिभाषित करने में मुख्य चरण होता है।[16] (U नामकरण उनकी उच्च यूरिडिन सामग्री से प्राप्त हुआ है)।

U4,U5,U6 कॉम्प्लेक्स जुड़ता है, और U6, U1 की जगह ले लेता है। U1 और U4 चले जाते हैं। शेष कॉम्प्लेक्स तब दो ट्रांसएस्टरिफिकेशन प्रतिक्रियाएं करता है। पहले ट्रांसएस्टरिफिकेशन में, इंट्रॉन के 5' सिरे को अपस्ट्रीम एक्सॉन से काट दिया जाता है और 2',5'-फॉस्फोडाइस्टर लिंकेज द्वारा शाखा साइट A से जोड़ा जाता है। दूसरे ट्रांसएस्टरिफिकेशन में, इंट्रॉन के 3' सिरे को डाउनस्ट्रीम एक्सॉन से काट दिया जाता है, और दोनों एक्सॉन को एक फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड द्वारा जोड़ दिया जाता है। इसके बाद इंट्रॉन लारीएट (lariat) रूप में जारी किया जाता है और निम्नीकृत (degrade) कर दिया जाता है।[1]

नियामक तत्व और प्रोटीन

स्प्लाइसिंग को ट्रांस-एक्टिंग प्रोटीन (रिप्रेसर और एक्टिवेटर) और प्री-mRNA पर संबंधित सिस-एक्टिंग नियामक स्थलों (साइलेंसर और एन्हांसर) द्वारा विनियमित किया जाता है। हालांकि, वैकल्पिक स्प्लाइसिंग की जटिलता के हिस्से के रूप में, यह ध्यान दिया जाता है कि स्प्लाइसिंग कारक के प्रभाव अक्सर स्थिति-निर्भर (position-dependent) होते हैं। यानी, एक स्प्लाइसिंग कारक जो एक इंट्रोनिक एन्हांसर तत्व से बंधे होने पर स्प्लाइसिंग एक्टिवेटर के रूप में कार्य करता है, वह एक्सॉन के संदर्भ में अपने स्प्लाइसिंग तत्व से बंधे होने पर एक रिпреसर के रूप में कार्य कर सकता है, और इसके विपरीत।[20] प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट की द्वितीयक संरचना भी स्प्लाइसिंग को विनियमित करने में भूमिका निभाती है, जैसे कि स्प्लाइसिंग तत्वों को एक साथ लाकर या किसी ऐसे अनुक्रम को छुपाकर जो अन्यथा स्प्लाइसिंग कारक के लिए बाइंडिंग तत्व के रूप में कार्य करता।[21][22] एक साथ मिलकर, ये तत्व एक "स्प्लाइसिंग कोड" बनाते हैं जो नियंत्रित करता है कि विभिन्न सेलुलर स्थितियों के तहत स्प्लाइसिंग कैसे होगी।[23][24]

प्री-mRNA में सिस-एक्टिंग आरएनए अनुक्रम तत्वों के दो प्रमुख प्रकार मौजूद हैं और उनके संबंधित ट्रांस-एक्टिंग आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन हैं। स्प्लाइसिंग 'साइलेंसर' ऐसे स्थल हैं जिनसे स्प्लाइसिंग रिप्रेशर प्रोटीन बंधते हैं, जिससे यह संभावना कम हो जाती है कि पास के स्थल का उपयोग स्प्लाइस जंक्शन के रूप में किया जाएगा। ये या तो खुद इंट्रॉन में (इंट्रोनिक स्प्लाइसिंग साइलेंसर, ISS) या पड़ोसी एक्सॉन (एक्सोनिक स्प्लाइसिंग साइलेंसर, ESS) में स्थित हो सकते हैं। वे अनुक्रम में, साथ ही उनसे जुड़ने वाले प्रोटीनों के प्रकारों में भिन्न होते हैं। अधिकांश स्प्लाइसिंग रिप्रेसर हेटरोजीनस न्यूक्लियर रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन (hnRNPs) होते हैं जैसे hnRNPA1 और पॉलिपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट-बाइंडिंग प्रोटीन (PTB)।[16][23] स्प्लाइसिंग 'एन्हांसर' ऐसे स्थल हैं जिनसे स्प्लाइसिंग एक्टिवेटर प्रोटीन बंधते हैं, जिससे यह संभावना बढ़ जाती है कि पास के स्थल का उपयोग स्प्लाइस जंक्शन के रूप में किया जाएगा। ये भी इंट्रॉन (इंट्रोनिक स्प्लाइसिंग एन्हांसर, ISE) या एक्सॉन (एक्सोनिक स्प्लाइसिंग एन्हांसर, ESE) में हो सकते हैं। ISE और ESE से जुड़ने वाले अधिकांश एक्टिवेटर प्रोटीन एसआर प्रोटीन परिवार के सदस्य होते हैं। ऐसे प्रोटीनों में आरएनए पहचान मोटिफ और आर्जिनीन तथा सेरीन-समृद्ध (RS) डोमेन होते हैं।[16][23]

सामान्य तौर पर, स्प्लाइसिंग के निर्धारक एक परस्पर-निर्भर तरीके से काम करते हैं जो संदर्भ (context) पर निर्भर करता है, ताकि स्प्लाइसिंग को कैसे नियंत्रित किया जाता है, इसके नियम एक स्प्लाइसिंग कोड बनाते हैं।[24] किसी विशेष सिस-एक्टिंग आरएनए अनुक्रम तत्व की उपस्थिति कुछ मामलों में पास के स्थल के स्प्लाइस होने की संभावना को बढ़ा सकती है, लेकिन अन्य मामलों में संदर्भ के आधार पर संभावना को कम कर सकती है। जिस संदर्भ में नियामक तत्व कार्य करते हैं, उनमें सिस-एक्टिंग संदर्भ शामिल होता है जो अन्य आरएनए अनुक्रम विशेषताओं की उपस्थिति से स्थापित होता है, और ट्रांस-एक्टिंग संदर्भ जो सेलुलर स्थितियों द्वारा स्थापित होता है। उदाहरण के लिए, कुछ सिस-एक्टिंग आरएनए अनुक्रम तत्व स्प्लाइसिंग को तभी प्रभावित करते हैं जब संदर्भ स्थापित करने के लिए एक ही क्षेत्र में कई तत्व मौजूद हों। दूसरे उदाहरण के रूप में, एक सिस-एक्टिंग तत्व का स्प्लाइसिंग पर विपरीत प्रभाव हो सकता है, इस बात पर निर्भर करता है कि कोशिका में कौन से प्रोटीन व्यक्त (express) होते हैं (उदाहरण के लिए, न्यूरोनल बनाम गैर-न्यूरोनल PTB)। स्प्लाइसिंग साइलेंसर और एन्हांसर का अनुकूली महत्व उन अध्ययनों से प्रमाणित होता है जो यह दिखाते हैं कि मानव जीनों में उन उत्परिवर्तनों (mutations) के खिलाफ मजबूत चयन होता है जो नए साइलेंसर बनाते हैं या मौजूदा एन्हांसर को बाधित करते हैं।[25][26]

उदाहरण

एक्सॉन स्किपिंग: ड्रोसोफिला dsx

ड्रोसोफिला मेलानोमास्टर जीन dsx के प्री-mRNA में 6 एक्सॉन होते हैं। पुरुषों में, mRNA बनाने के लिए एक्सॉन 1, 2, 3, 5 और 6 जुड़ जाते हैं, जो पुरुष विकास के लिए आवश्यक एक अनुलेखीय नियामक प्रोटीन को एनकोड करता है। महिलाओं में, एक्सॉन 1, 2, 3 और 4 जुड़ जाते हैं, और एक्सॉन 4 में एक पॉलियाडेनिलेशन संकेत उस बिंदु पर mRNA के क्लीवेज (खंडन) का कारण बनता है। परिणामी mRNA महिला विकास के लिए आवश्यक एक अनुलेखीय नियामक प्रोटीन है।[27]

यह एक्सॉन स्किपिंग का एक उदाहरण है। एक्सॉन 4 से अपस्ट्रीम इंट्रॉन में एक पॉलिपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट होता है जो सर्वसम्मति अनुक्रम से अच्छी तरह मेल नहीं खाता है, जिससे स्प्लाइसिंग एक्टिवेटर की सहायता के बिना U2AF प्रोटीन इससे कम जुड़ते हैं। इसलिए पुरुषों में इस 3' स्प्लाइस स्वीकर्ता साइट का उपयोग नहीं किया जाता है। हालाँकि, स्त्रियाँ स्प्लाइसिंग एक्टिवेटर ट्रांसफॉर्मर (Tra) का उत्पादन करती हैं (नीचे देखें)। SR प्रोटीन Tra2 दोनों लिंगों में उत्पन्न होता है और एक्सॉन 4 में एक ESE से जुड़ता है; यदि Tra मौजूद है, तो यह Tra2 से जुड़ता है और, एक अन्य SR प्रोटीन के साथ मिलकर, एक कॉम्प्लेक्स बनाता है जो कमजोरलिपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट से जुड़ने में U2AF प्रोटीन की सहायता करता है। U2 को संबंधित शाखा बिंदु पर भर्ती (recruit) किया जाता है, और इससे mRNA में एक्सॉन 4 शामिल हो जाता है।[27][28]

वैकल्पिक स्वीकर्ता स्थल: ड्रैसोफिला Transformer

ड्रैसोफिला मेलैनोगैस्टर के Transformer (Tra) जीन के प्री-mRNA वैकल्पिक स्वीकर्ता स्थल (alternative acceptor site) मोड के माध्यम से वैकल्पिक स्प्लिसिंग से गुजरते हैं। Tra जीन एक ऐसे प्रोटीन को एनकोड करता है जो केवल मादाओं में व्यक्त होता है। इस जीन के प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट में एक ऐसा इंट्रॉन होता है जिसके दो संभावित स्वीकर्ता स्थल होते हैं। नरों में, अपस्ट्रीम स्वीकर्ता स्थल का उपयोग किया जाता है। इसके कारण प्रसंस्कृत ट्रांसक्रिप्ट में एक्सॉन 2 का एक लंबा संस्करण शामिल हो जाता है, जिसमें एक प्रारंभिक स्टॉप कोडॉन भी शामिल होता है। परिणामी mRNA एक truncated (खंडित) प्रोटीन उत्पाद को एनकोड करता है जो निष्क्रिय होता है। मादाएं मास्टर सेक्स निर्धारण प्रोटीन Sex lethal (Sxl) का उत्पादन करती हैं। Sxl प्रोटीन एक स्प्लिसिंग रिप्रेसर है जो अपस्ट्रीम स्वीकर्ता स्थल के पास Tra ट्रांसक्रिप्ट के RNA में एक ISS से जुड़ता है, जिससे U2AF प्रोटीन को पॉलीपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट से जुड़ने से रोकता है। यह इस जंक्शन के उपयोग को रोकता है, जिससे स्प्लिचसोम का बंधन डाउनस्ट्रीम स्वीकर्ता स्थल की ओर स्थानांतरित हो जाता है। इस बिंदु पर स्प्लिसिंग स्टॉप कोडॉन को दरकिनार कर देती है, जिसे इंट्रॉन के हिस्से के रूपل में काट दिया जाता है। परिणामी mRNA एक सक्रिय Tra प्रोटीन को एनकोड करता है, जो स्वयं अन्य सेक्स-संबंधित जीनों की वैकल्पिक स्प्लिसिंग का एक नियामक है (ऊपर dsx देखें)।[1]

एक्सॉन परिभाषा: Fas रिसेप्टर

Fas रिसेप्टर प्रोटीन के कई आइसोफॉर्म वैकल्पिक स्प्लिसिंग द्वारा उत्पादित होते हैं। मनुष्यों में सामान्य रूप से होने वाले दो आइसोफॉर्म एक्सॉन-स्किपिंग तंत्र द्वारा उत्पादित होते हैं। एक्सॉन 6 को शामिल करने वाले mRNA में Fas रिसेप्टर का झिल्ली-बद्ध (membrane-bound) रूप एनकोड होता है, जो एपोप्टोसिस (apoptosis), या प्रोग्राम्ड सेल डेथ को बढ़ावा देता है। सूर्य के संपर्क में लंबे समय तक रहने वाली त्वचा की कोशिकाओं में Fas रिसेप्टर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति, और त्वचा के कैंसर की कोशिकाओं में इसकी अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति, यह सुझाव देती है कि यह तंत्र मनुष्यों में पूर्व-कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने में महत्वपूर्ण हो सकता है।[29] यदि एक्सॉन 6 को छोड़ (skip) दिया जाता है, तो परिणामी mRNA एक घुलनशील Fas प्रोटीन को एनकोड करता है जो एपोप्टोसिस को बढ़ावा नहीं देता है। एक्सॉन को शामिल करना या छोड़ना दो विरोधी (antagonistic) प्रोटीनों, TIA-1 और पॉलीपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट-बाइंडिंग प्रोटीन (PTB) पर निर्भर करता है।

  • प्री-mRNA में एक्सॉन 6 से नीचे की ओर (downstream) इंट्रॉन में 5' डोनर साइट सर्वसम्मति अनुक्रम (consensus sequence) के साथ एक कमजोर समझौते पर आधारित है, और आमतौर पर यह U1 snRNP द्वारा बाध्य नहीं होती है। यदि U1 नहीं जुड़ता है, तो एक्सॉन को छोड़ दिया जाता है (साथ में दी गई आकृति में "a" देखें)।
  • एक इंट्रॉनी स्प्लिसिंग एन्हांसमेंट साइट पर TIA-1 प्रोटीन का बंधन U1 snRNP के बंधन को स्थिर करता है।[16] परिणामी 5' डोनर साइट कॉम्प्लेक्स एक ऐसे तंत्र के माध्यम से एक्सॉन के अपस्ट्रीम 3' स्प्लिस साइट पर स्प्लिसिंग कारक U2AF के बंधन में सहायता करता है जो अभी तक ज्ञात नहीं है (b देखें)।[30]
  • एक्सॉन 6 में एक पाइरीमिडाइन-समृद्ध एक्सॉन स्प्लिसिंग साइलेसर, ure6 होता है, जहां PTB जुड़ सकता है। यदि PTB जुड़ता है, तो यह स्वीकर्ता स्थल पर U2AF के बंधन पर 5' डोनर कॉम्प्लेक्स के प्रभाव को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक्सॉन स्किपिंग होती है (c देखें)।

यह तंत्र स्प्लिसिंग में एक्सॉन परिभाषा (exon definition) का एक उदाहरण है। एक स्प्लिचसोम एक इंट्रॉन पर एकत्रित होता है, और snRNP सबयूनिट्स RNA को इस तरह मोड़ते हैं कि इंट्रॉन के 5' और 3' सिरे जुड़ जाते हैं। हालांकि, हाल ही में अध्ययन किए गए उदाहरण जैसे कि यह दिखाते हैं कि एक्सॉन के सिरों के बीच भी परस्पर क्रिया होती है। इस विशेष मामले में, दोनों फ़्लैंकिंग इंट्रॉनों पर स्प्लिचसोम के संयोजन से पहले कोर स्प्लिसिंग कारकों के बंधन की अनुमति देने के लिए ये एक्सॉन परिभाषा इंटरेक्शन आवश्यक हैं।[30]

रिप्रेसर-एक्टिवेटर प्रतिस्पर्धा: HIV-1 tat एक्सॉन 2

HIV, वह रेट्रोवाइरस जो मनुष्यों में AIDS का कारण बनता है, एक एकल प्राथमिक RNA ट्रांसक्रिप्ट का उत्पादन करता है, जिसे 40 से अधिक विभिन्न mRNA उत्पन्न करने के लिए कई तरीकों से वैकल्पिक रूप से स्प्लिस किया जाता है।[31] अलग-अलग स्प्लिस किए गए ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच संतुलन कई ऐसे mRNA प्रदान करता है जो विभिन्न उत्पादों को एनकोड करते हैं जो वायरल गुणन के लिए आवश्यक होते हैं।[32] अलग-अलग स्प्लिस किए गए ट्रांसक्रिप्ट्स में से एक में tat जीन होता है, जिसमें एक्सॉन 2 एक कैसेट एक्सॉन है जिसे छोड़ा या शामिल किया जा सकता है। RNA में tat एक्सॉन 2 को शामिल करना स्प्लिसिंग रिप्रेसर hnRNP A1 और SR प्रोटीन SC35 के बीच प्रतिस्पर्धा द्वारा नियंत्रित होता है। एक्सॉन 2 के भीतर एक एक्सॉन स्प्लिसिंग साइलेसर अनुक्रम (ESS) और एक एक्सॉन स्प्लिसिंग एन्हांसर अनुक्रम (ESE) ओवरलैप होते हैं। यदि A1 रिप्रेसर प्रोटीन ESS से जुड़ता है, तो यह कई A1 अणुओं के सहकारी बंधन (cooperative binding) को शुरू करता है, जो एक्सॉन 2 के अपस्ट्रीम 5' डोनर साइट तक फैलता है और पॉलीपाइरीमिडाइन ट्रैक्ट से कोर स्प्लिसिंग कारक U2AF35 के बंधन को रोकता है। यदि SC35 ESE से जुड़ता है, तो यह A1 के बंधन को रोकता है और स्प्लिचसोम के संयोजन के लिए 5' डोनर साइट को सुलभ स्थिति में रखता है। एक्टिवेटर और रिप्रेसर के बीच प्रतिस्पर्धा यह सुनिश्चित करती है कि दोनों प्रकार के mRNA (एक्सॉन 2 के साथ और उसके बिना) उत्पन्न हों।[31]

अनुकूलन महत्व (Adaptive significance)

कई उत्पादों (प्रोटीन या गैर-कोडिंग RNA) का उत्पादन करने के लिए प्रोटीन-कोडिंग जीनों और गैर-कोडिंग जीनों दोनों में वास्तविक वैकल्पिक स्प्लिसिंग होती है। डीएनए अनुक्रम और प्रारंभिक ट्रांसक्रिप्ट को देखते हुए, यह तय करने के लिए बाहरी जानकारी की आवश्यकता होती है कि कौन सा उत्पाद बनाया जाता है। चूँकि विनियमन के तरीके आनुवंशिक होते हैं, यह जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए उत्परिवर्तन (mutations) के नए तरीके प्रदान करता है।[33]

वैकल्पिक स्प्लिसिंग विकास संबंधी लचीलापन प्रदान कर सकती है। एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन (point mutation) मूल प्रोटीन के नुकसान के बिना एक नए प्रोटीन आइसोफॉर्म के उत्पादन की अनुमति देते हुए, स्प्लिसिंग के दौरान किसी दिए गए एक्सॉन को कभी-कभी बाहर या शामिल करने का कारण बन सकता है।[1] अध्ययनों से पता चला है कि आंतरिक रूप से विकारयुक्त क्षेत्रों (intrinsically disordered regions) (देखें Intrinsically unstructured proteins) में गैर-संविधानिक (non-constitutive) एक्सॉन प्रचुर मात्रा में होते हैं,[34] जो यह सुझाव देता है कि प्रोटीन आइसोफॉर्म इन क्षेत्रों के भीतर कार्यात्मक मॉड्यूल के परिवर्तन के कारण कार्यात्मक विविधता प्रदर्शित कर सकते हैं। आइसोफॉर्म द्वारा प्राप्त ऐसी कार्यात्मक विविधता उनके अभिव्यक्ति पैटर्न में झलकैति है और इसे मशीन लर्निंग दृष्टिकोण द्वारा अनुमानित किया जा सकता है।[35][36] तुलनात्मक अध्ययन इंगित करते हैं कि वैकल्पिक स्प्लिसिंग विकास में बहुकोशिकीयता से पहले हुई थी, और सुझाव देते हैं कि बहुकोशिकीय जीवों के विकास में सहायता के लिए इस तंत्र को अपनाया गया होगा।[37]

मानव जीनोम परियोजना और अन्य जीनोम अनुक्रमण पर आधारित शोध से पता चला है कि मनुष्यों में गोलकृमि (roundworm) Caenorhabditis elegans की तुलना में केवल लगभग 30% अधिक जीन हैं, और मक्खी ड्रैसोफिला मेलैनोगैस्टर की तुलना में केवल लगभग दोगुने जीन हैं। इस खोज ने इस अटकल को जन्म दिया कि मनुष्यों, या आम तौर पर कशेरुकियों (vertebrates) की कथित अधिक जटिलता, अकशेरुकियों (invertebrates) की तुलना में मनुष्यों में वैकल्पिक स्प्लिसिंग की उच्च दरों के कारण हो सकती है।[38][39] हालांकि, मानव, चूहे, चूहे (rat), गाय, मक्खी (D. melanogaster), कृमि (C. elegans), और पौधे Arabidopsis thaliana से प्रत्येक के 100,000 व्यक्त अनुक्रम टैग (expressed sequence tags - EST) के नमूनों पर एक अध्ययन में मनुष्यों और परीक्षण किए गए अन्य जानवरों में से किसी के भी बीच वैकल्पिक रूप से स्प्लिस किए गए जीनों की आवृत्ति में कोई बड़ा अंतर नहीं पाया गया।[40] हालांकि, एक अन्य अध्ययन ने प्रस्तावित किया कि ये परिणाम विभिन्न जीवों के लिए उपलब्ध विभिन्न संख्या में EST का एक कलाकृत (artifact) थे। जब उन्होंने प्रत्येक जीव से जीनों के यादृच्छिक उपसमुच्चयों (random subsets) में वैकल्पिक स्प्लिसिंग आवृत्तियों की तुलना की, तो लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि कशेरुकियों में वास्तव में अकशेरुकियों की तुलना में वैकल्पिक स्प्लिसिंग की दर अधिक होती है।[41]

रोग (Disease)

RNA प्रसंस्करण मशीनरी में परिवर्तन कई ट्रांसक्रिप्ट्स की गलत-स्प्लिसिंग (mis-splicing) का कारण बन सकते हैं, जबकि स्प्लिस स्थलों में एकल-न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन या सिस-अभिनव स्प्लिसिंग नियामक स्थल एक एकल जीन की स्प्लिसिंग में अंतर पैदा कर सकते हैं, और इस प्रकार एक उत्परिवर्ती जीन के ट्रांसक्रिप्ट्स से उत्पादित mRNA में अंतर पैदा कर सकते हैं। 2005 में प्रायिकता विश्लेषण से जुड़े एक अध्ययन ने संकेत दिया कि मानव रोग पैदा करने वाले 60% से अधिक उत्परिवर्तन (mutations) सीधे कोडिंग अनुक्रमों को प्रभावित करने के बजाय स्प्लिसिंग को प्रभावित करते हैं।[42] हाल ही का एक अध्ययन इंगित करता है कि सभी आनुवंशिक रोगों में से एक तिहाई में स्प्लिसिंग घटक होने की संभावना है।[20] सटीक प्रतिशत चाहे जो भी हो, स्प्लिसिंग से संबंधित कई बीमारियां वास्तव में मौजूद हैं।[43] जैसा कि नीचे वर्णित है, स्प्लिसिंग से संबंधित रोगों का एक प्रमुख उदाहरण कैंसर है।

असामान्य रूप से स्प्लिस किए गए mRNA भी कैंसर कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात में पाए जाते हैं।[44][45][46] संयुक्त RNA-Seq और प्रोटीमिक्स विश्लेषणों ने महत्वपूर्ण कैंसर मार्गों में प्रमुख प्रोटीनों के स्प्लिस आइसोफॉर्म की हड़ताली विभेदक अभिव्यक्ति का खुलासा किया है।[47] यह हमेशा स्पष्ट नहीं होता है कि स्प्लिसिंग के इस तरह के विकृत पैटर्न कैंसर के विकास में योगदान करते हैं या केवल कैंसर से जुड़ी सेलुलर असामान्यताओं का परिणाम हैं। कुछ प्रकार के कैंसर के लिए, जैसे कि कोलोरेक्टल और प्रोस्टेट में, प्रति कैंसर स्प्लिसिंग त्रुटियों की संख्या व्यक्तिगत कैंसर के बीच काफी भिन्न पाई गई है, एक ऐसी घटना जिसे ट्रांसक्रिप्टोम अस्थिरता (transcriptome instability) कहा जाता है।[48][49] ट्रांसक्रिप्टोम अस्थिरता को स्प्लिसिंग फैक्टर जीनों के घटे हुए अभिव्यक्ति स्तर के साथ काफी हद तक सहसंबद्ध (correlate) दिखाया गया है। DNMT3A के उत्परिवर्तन को हेमेटोलॉजिक मैलिग्नेंसी (hematologic malignancies) में योगदान करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, और यह कि DNMT3A-उत्परिवर्तित सेल लाइनें अपने आइसोजेनिक वाइल्डटाईप समकक्षों की तुलना में ट्रांसक्रिप्टोम अस्थिरता प्रदर्शित करती हैं।[50]

वास्तव में, सामान्य कोशिकाओं की तुलना में कैंसर कोशिकाओं में वैकल्पिक स्प्लिसिंग की कमी होती है, और स्प्लिसिंग के प्रकार भिन्न होते हैं; उदाहरण के लिए, कैंसर कोशिकाओं में सामान्य कोशिकाओं की तुलना में इंट्रॉन प्रतिधारण (intron retention) का उच्च स्तर दिखाई देता है, लेकिन एक्सॉन स्किपिंग का स्तर कम होता है।[51] कैंसर कोशिकाओं में स्प्लिसिंग में कुछ अंतर स्प्लिसिंग फैक्टर जीनों में दैहिक उत्परिवर्तन (somatic mutations) की उच्च आवृत्ति के कारण हो सकते हैं,[46] और कुछ ट्रांस-एक्टिंग स्प्लिसिंग कारकों के फॉस्फोरिलीकरण (phosphorylation) में परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकते हैं।[33] अन्य उत्पादित स्प्लिसिंग कारकों की सापेक्ष मात्रा में परिवर्तन से उत्पन्न हो सकते हैं; उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर की कोशिकाओं में स्प्लिसिंग कारक SF2/ASF का बढ़ा हुआ स्तर देखा गया है।[52] एक अध्ययन में पाया गया कि वैकल्पिक स्प्लिसिंग वेरिएंट का एक अपेक्षाकृत छोटा प्रतिशत (26000 से अधिक में से 383) सामान्य कोशिकाओं की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं में आवृत्ति में काफी अधिक था, जो यह सुझाव देता है कि जीनों का एक सीमित समूह है जो गलत तरीके से स्प्लिस होने पर, ट्यूमर के विकास में योगदान देता है।[53] हालांकि यह माना जाता है कि गलत तरीके से स्प्लिस किए गए ट्रांसक्रिप्ट्स के हानिकारक प्रभावों को आमतौर पर नॉनसेंस-मीडिएटेड mRNA क्षय (nonsense-mediated mRNA decay) [NMD] नामक एक सेलुलर पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र द्वारा सुरक्षित और समाप्त किया जाता है।[54]

कैंसर से जुड़ा एक विशिष्ट स्प्लिसिंग वेरिएंट का उदाहरण मानव DNMT जीनों में से एक में है। तीन DNMT जीन ऐसे एंजाइमों को एनकोड करते हैं जो DNA में मिथाइल समूह जोड़ते हैं, एक ऐसा संशोधन जिसका अक्सर नियामक प्रभाव होता है। कई असामान्य रूप से स्प्लिस किए गए DNMT3B mRNA ट्यूमर और कैंसर सेल लाइनों में पाए जाते हैं। दो अलग-अलग अध्ययनों में, स्तनधारी कोशिकाओं में इनमें से दो असामान्य रूप से स्प्लिस किए गए mRNA की अभिव्यक्ति ने उन कोशिकाओं में DNA methylation पैटर्न में परिवर्तन का कारण बना। असामान्य mRNA में से एक वाली कोशिकाएं नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में दोगुनी तेजी से बढ़ीं, जो इस उत्पाद द्वारा ट्यूमर के विकास में प्रत्यक्ष योगदान का संकेत देती हैं।[33]

दूसरा उदाहरण Ron (MST1R) प्रोटो-ऑन्कोजीन है। कैंसर कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण गुण सामान्य ऊतक को स्थानांतरित करने और आक्रमण करने की उनकी क्षमता है। स्तन कैंसर कोशिकाओं में SF2/ASF के बढ़े हुए स्तर के साथ Ron के एक असामान्य रूप से स्प्लिस किए गए ट्रांसक्रिप्ट का उत्पादन जुड़ा हुआ पाया गया है। इस mRNA द्वारा एनकोड किया गया Ron प्रोटीन का असामान्य आइसोफॉर्म सेल गतिशीलता (cell motility) की ओर जाता है।[52]

FOSB जीन के एक छोटे किए गए स्प्लाइस्ड वेरिएंट – ΔFosB – की न्यूक्लियस एक्यूम्बेंस में न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट आबादी में ओवरएक्सप्रेशन की पहचान दवाओं और प्राकृतिक पुरस्कारों के प्रति लत के प्रेरण (इंडक्शन) और रखरखाव में शामिल कारणात्मक तंत्र के रूप में की गई है।[55][56][57][58]

हाल के उत्तेजक अध्ययन वैकल्पिक स्प्लाइंसिंग विनियमन में क्रोमैटिन संरचना और हिस्टोन संशोधनों के एक मुख्य कार्य की ओर इशारा करते हैं। ये अंतर्दृष्टि सुझाती हैं कि एपिजेनेटिक विनियमन न केवल यह निर्धारित करता है कि जीनोम के कौन से हिस्से व्यक्त (एक्सप्रेस) होते हैं बल्कि यह भी कि उन्हें कैसे स्प्लाइस्ड किया जाता है।[59]

जीनोम-स्केल (ट्रांसक्रिप्टोम-व्यापी) विश्लेषण

वैकल्पिक स्प्लिसिंग का ट्रांसक्रिप्टोम-व्यापी विश्लेषण आमतौर पर उच्च-थ्रूपुट आरएनए-सिक्वेंसिंग द्वारा किया जाता है। सबसे आम तौर पर, इलुमिना इंस्ट्रुमेंटेशन जैसे शॉर्ट-रीड सिक्वेंसिंग द्वारा। लेकिन इससे भी अधिक जानकारीपूर्ण, नैनोपोर या पैबियो इंस्ट्रुमेंटेशन जैसे लॉन्ग-रीड सिक्वेंसिंग द्वारा होता है। ट्रांसक्रिप्टोम-व्यापी विश्लेषण का उपयोग उदाहरण के लिए कैंसर समूह (कोहोर्ट) की तरह विचलन वाले वैकल्पिक स्प्लिसिंग की मात्रा को मापने के लिए किया जा सकता है।[60]

अनप्रोसैस्ड और प्रोसैस्ड दोनों mRNAs के जीनोम-व्यापी विश्लेषण करने के लिए डीप सिक्वेंसिंग तकनीकों का उपयोग किया गया है; इस प्रकार वैकल्पिक स्प्लिसिंग में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, डीप सिक्वेंसिंग के उपयोग के परिणाम बताते हैं कि, मनुष्यों में, मल्टीएक्सॉन जीनों से अनुमानित 95% ट्रांसक्रिप्ट वैकल्पिक स्प्लिसिंग से गुजरते हैं, जिसमें कई प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट ऊतक-विशिष्ट (टिश्यू-स्पेसिफिक) तरीके से स्प्लाइस्ड होते हैं।[2] वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस्ड आइसोफॉर्म्स के लिए कार्यों की भविष्यवाणी करने हेतु आरएनए-सेक डेटा को एकीकृत करने के लिए कार्यात्मक जीनोमिक्स और मल्टीपल इंस्टेंस लर्निंग पर आधारित कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण भी विकसित किए गए हैं।[36] डीप सिक्वेंसिंग ने स्प्लिसिंग के दौरान जारी होने वाले क्षणिक लारियाट के इन विवो (जीव के भीतर) का पता लगाने, शाखा स्थल (ब्रांच साइट) अनुक्रमों के निर्धारण, और मानव प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट में ब्रांचपॉइंट्स के बड़े पैमाने पर मानचित्रण में भी सहायता की है।[61]

अधिक ऐतिहासिक रूप से, वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस्ड ट्रांसक्रिप्ट EST अनुक्रमों की तुलना करके पाए गए हैं, लेकिन इसके लिए बहुत बड़ी संख्या में ESTs के अनुक्रमण (सिक्वेंसिंग) की आवश्यकता होती है। अधिकांश EST लाइब्रेरी बहुत सीमित संख्या में ऊतकों से आती हैं, इसलिए ऊतक-विशिष्ट स्प्लिस वेरिएंट के किसी भी स्थिति में छूट जाने की संभावना होती है। स्प्लिसिंग की जांच के लिए उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण, हालांकि, विकसित किए गए हैं, जैसे कि: [[डीएनए माइक्रोरै-आधारित विश्लेषण, आरएनए-बाइंडिंग परख, और डीप सिक्वेंसिंग। इन तरीकों का उपयोग प्रोटीन बाइंडिंग को प्रभावित करने वाले स्प्लिसिंग तत्वों में या उसके आस-पास बहुरूपता (पॉलीमॉर्फिज्म) या उत्परिवर्तन (म्यूटेशन) के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। जब इन विवो रिपोर्टर जीन परख सहित स्प्लिसिंग परिक्षणों के साथ जोड़ा जाता है, तो प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट के स्प्लिसिंग पर बहुरूपता या उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभावों का विश्लेषण किया जा सकता है।[20][23][62]

माइक्रोरै विश्लेषण में, व्यक्तिगत एक्सॉन (उदा. एफ़िमेट्रिक्स एक्सॉन माइक्रोरै) या एक्सॉन/एक्सॉन सीमाओं (उदा. एक्सॉनहिट या जीवन के एरे) का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए खंडों के एरे का उपयोग किया गया है। इसके बाद एरे को रुचि के ऊतकों से लेबल किए गए cDNA के साथ परखा जाता है। जांच (प्रोब) cDNA उन एक्सॉन के डीएनए से बंधते हैं जो उनके मूल ऊतक में mRNAs में शामिल होते हैं, या उस सीमा से डीएनए पर जहां दो एक्सॉन जुड़े हुए हैं। यह विशेष वैकल्पिक रूप से स्प्लाइस्ड mRNAs की उपस्थिति को प्रकट कर सकता है।[63]

CLIP (क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेविटेशन) स्प्लिसिंग के दौरान किसी ऊतक में प्रोटीन को आरएनए अणुओं से जोड़ने के लिए यूवी विकिरण का उपयोग करता है। इसके बाद रुचि के ट्रांस-एक्टिंग स्प्लिसिंग नियामक प्रोटीन को विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके अवक्षेपित (प्रेcipitate) किया जाता है। जब उस प्रोटीन से जुड़ा आरएनए अलग और क्लोन किया जाता है, तो यह उस प्रोटीन के लिए लक्ष्य अनुक्रमों को प्रकट करता है।[64] आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान करने और प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट के उनके बाइंडिंग का मानचित्रण करने की एक अन्य विधि "माइक्रोरै इवैल्यूएशन ऑफ जीनोमिक एप्टामर्स बाय शिफ्ट (MEGAshift)" है।[65] इस पद्धति में माइक्रोरै-आधारित रीडआउट के साथ "सिस्टेमैटिक इवोल्यूशन ऑफ लिगैंड्स बाय एक्सपोनेंशियल एनरिचमेंट (SELEX)" पद्धति का अनुकूलन शामिल है।[66] MEGAshift पद्धति के उपयोग ने प्री-mRNA ट्रांसक्रिप्ट में अनुक्रमों की पहचान की अनुमति देकर वैकल्पिक स्प्लिसिंग के विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान की है जो विभिन्न स्प्लिसिंग कारकों, जैसे ASF/SF2 और PTB के साथ बाइंडिंग को मध्यस्थ करते हैं।[67] इस दृष्टिकोण का उपयोग आरएनए द्वितीयक संरचना और स्प्लिसिंग कारकों की बाइंडिंग के बीच के संबंध को निर्धारित करने में सहायता के लिए भी किया गया है।[22]

रिपोर्टर परख का उपयोग ऐसे रिपोर्टर जीनों का निर्माण करके एक विशिष्ट वैकल्पिक स्प्लिसिंग घटना में शामिल स्प्लिसिंग प्रोटीन को ढूंढना संभव बनाता है जो होने वाली स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया के आधार पर दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक को व्यक्त करेंगे। इस पद्धति का उपयोग स्प्लिसिंग को प्रभावित करने वाले म्यूटेंट को अलग करने और इस प्रकार उन म्यूटेंट में निष्क्रिय नए स्प्लिसिंग नियामक प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया गया है।[64]

प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी में हाल की प्रगति ने जीनोम एनोटेशन और वैकल्पिक स्प्लिसिंग विश्लेषण के लिए नए टूल के विकास को सुगम बनाया है। उदाहरण के लिए, isoform.io, प्रोटीन संरचना भविष्यवाणियों द्वारा निर्देशित एक मंच है, जिसने विभिन्न मानव ऊतकों में कई आरएनए अनुक्रमण प्रयोगों से एकत्रित मानव प्रोटीन-कोडिंग जीनों के सैकड़ों हजारों आइसोफॉर्म का मूल्यांकन किया है। इस व्यापक विश्लेषण के परिणामस्वरूप नवीनतम मानव जीन डेटाबेस में विहित (कैनोनिकल) आइसोफॉर्म की तुलना में अधिक आत्मविश्वास से अनुमानित संरचना और संभावित रूप से बेहतर कार्य वाले कई आइसोफॉर्म की पहचान हुई है। संरचनात्मक भविष्यवाणियों को अभिव्यक्ति और विकासवादी साक्ष्य के साथ एकीकृत करके, इस दृष्टिकोण ने मानव जीनोम के एनोटेशन को परिष्कृत करने के लिए एक उपकरण के रूप में प्रोटीन संरचना भविष्यवाणी की क्षमता को प्रदर्शित किया है।[68]

डेटाबेस

वैकल्पिक स्प्लिसिंग डेटाबेस का एक संग्रह है।[69][70][71] ये डेटाबेस प्री-mRNA से गुजरने वाले जीनों को खोजने और वैकल्पिक स्प्लिसिंग घटनाओं या वैकल्पिक स्प्लिसिंग के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं।

इन्हें भी देखें

संदर्भ

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बाहरी कड़ियाँ

fr:Épissage#Épissage alternatif it:Splicing#Splicing alternativo

स्रोत: अंग्रेज़ी विकिपीडिया के “Alternative splicing” लेख का अनुवाद। मूल लेख: https://en.wikipedia.org/wiki/Alternative_splicing यह अनुवाद स्वचालित रूप से तैयार किया गया है।

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